基于NRG/ErbB通路探讨三七总皂苷对偏头痛大鼠的作用机制*

李祥欣， 张保朝， 刘义锋， 刘少哲， 裴 双， 余 洋， 温昌明

（南阳市中心医院，河南南阳 473000）

偏头痛临床表现为头部搏动样疼痛的中枢神经系统功能障碍疾病，病程复杂，反复发作，常伴有恶心、呕吐等症状，严重影响患者生活质量［1］，但发病机制目前尚不明确。目前临床上常用曲普坦类药物治疗偏头痛，但效果不佳，且不能从根本上治疗疾病［2］，因此寻找新的治疗方案对于缓解疾病意义重大。三七总皂苷（total saponins ofPanax notoginseng，TSPN）作为三七的有效成分，对神经功能具有保护作用［3］，但具体机制尚不清楚。神经调节蛋白（neuregulin，NRG）/表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，ErbB）信号通路作为脑神经元中信号传导通路，对神经元具有保护作用［4］；在抑郁大鼠模型中能保护神经元免受损伤，实现对疾病的缓解［5］，但尚未显示其在偏头痛中的研究。因此，本研究采用硝酸甘油溶液皮下注射制备偏头痛大鼠模型，探讨TSPN 对偏头痛的保护机制，以期为临床上TSPN治疗偏头痛提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 动物

48 只SD 大鼠（SPF 级、雄性），6 周龄，体重（190±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（京）2016-0011。温度（23±0.5）℃、湿度（50±5）%、12 h 光照/12 h 黑暗条件下正常饮水摄食。本研究实验动物符合3R 原则，本研究遵守国际疼痛研究协会实验动物护理和指南有关规定，经本院伦理协会审核并通过。

2 主要试剂

硝酸甘油溶液（北京益民药业有限公司，批准文号：国药准字H11020289，规格：1 mL：5 mg×1支/盒）；三七总皂苷片（滇虹药业集团玉溪生物制药有限公司，批准文号：国药准字Z53021487）；NRG/ErbB 通路抑制剂AG825（Biosource）；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色液（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1120）；大鼠白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、β-内啡肽（β-endorphin，β-EP）、降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒及NRG1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、caspase-3 和cleaved caspase-3 抗体（Abcam，货号分别为：ab234570、ab255730、ab114804、ab274398、ab203548、ab191139、ab237715、ab32121、ab19391、ab184787 和ab52072）；大鼠一氧化氮（nitric oxide，NO）ELISA 试剂盒（上海润裕生物科技有限公司，货号：18941）。ChemiDoc XRS+蛋白成像系统（Bio-Rad）。

3 主要方法

3.1 实验分组及建模 SD 大鼠随机分为对照组（control group）、模型组（model group）、TSPN 组（TSPN group；10 mg/kg TSPN）和TSPN+抑制剂组（TSPN+inhibitor group；10 mg/kg TSPN+50 μg/kg AG825），每组12 只。TSPN 组参考人与动物等效剂量换算法灌胃10 mg/kg TSPN［6］，TSPN+抑制剂组在TSPN 组基础上尾静脉注射50 μg/kg AG825，对照组和模型组分别灌胃和静脉注射等体积生理盐水，每天1次，连续1周。

末次给药1 h 后，模型组、TSPN 组和TSPN+抑制剂组大鼠参考Tassorelli 等［7］方法建立偏头痛模型：大鼠按10 mg/kg（2 mL）剂量硝酸甘油溶液皮下注射，当大鼠出现耳红、爬笼、挠头、咬尾、往返运动增加等现象，则为造模成功。对照组大鼠相同部位注射等体积生理盐水。

3.2 各组行为学评分 记录各组大鼠连续30 min内出现爬笼、挠头、咬尾和往返运动次数，每个症状出现1 次记1 分［8］，以造模成功为0 min，共记录0～30 min、60～90 min 和120～150 min 三个时段。观察耳红出现时间和耳红消失时间。

3.3 样本收集 实验结束后腹主动脉采血，加入促凝管中，1 200×g离心10 min，收集血清，置于-20 ℃冰箱备用；断头处死，取脑组织，随机6 只置于4%多聚甲醛中固定，另6只置于-80 ℃冰箱保存。

3.4 HE 染色检测脑组织神经元形态 取出4%多聚甲醛中固定组织，石蜡切片（厚度：5 μm），二甲苯脱蜡、乙醇水合，经苏木精染色、盐酸分化、伊红复染后，显微镜下观察脑组织神经元形态。

3.5 ELISA 检测血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平及脑组织中5-HT、β-EP和CGRP含量 取出血清，参考大鼠ELISA试剂盒说明书检测血清中NO、IL-6和IL-1β水平；脑组织取0.5 mg，加入预冷的磷酸盐缓冲液，冰上匀浆，1 200×g离心25 min，取上清，参考大鼠ELISA 试剂盒说明书检测脑组织中5-HT、β-EP 和CGRP含量。

3.6 Western blot 法检测脑组织中NRG1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、caspase-3 和cleaved caspase-3 蛋白表达情况 取30 mg 脑组织，冰上匀浆，RIPA 裂解液裂解组织，10 000×g、4 ℃离心20 min，上清为总蛋白，上样20 μg 蛋白、PVDF 膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入Ⅰ抗（NRG1，1∶1 000；ErbB2，1∶1 000；ErbB3，1∶500；ErbB4，1∶500；caspase-3，1∶2 000；cleaved caspase-3，1∶2 000）于4 ℃孵育过夜；加入对应Ⅱ抗，室温孵育1 h；ECL 化学发光液避光显色，蛋白成像系统拍照和定量分析。

4 统计学处理

数据均采用GraphPad Prism7.0进行分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）描述。多组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 TSPN对大鼠头痛发作时行为学和耳红的影响

与对照组相比，模型组和TSPN+抑制剂组在0～30 min、60～90 min 和120～150 min 的行为学评分，以及TSPN 组在0～30 min和60～90 min的行为学评分显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，TSPN 组在0～30 min、60～90 min 和120～150 min 的行为学评分，以及TSPN+抑制剂组在60～90 min 和120～150 min 的行为学评分显著降低（P＜0.05），TSPN 组耳红出现时间延长（P＜0.05），TSPN 组和TSPN+抑制剂组耳红消失时间缩短（P＜0.05）；与TSPN 组相比，TSPN+抑制剂组在0～30 min、60～90 min 和120～150 min 行为学评分升高（P＜0.05），耳红出现时间缩短（P＜0.05），耳红消失时间延长（P＜0.05），见图1、2。

Figure 1. Comparison of behavioral scores during headache attack of the rats in the 4 groups. Mean±SD.n=12.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.图1 4组大鼠头痛发作时行为学评分比较

Figure 2. The appearance time and disappearance time of the rats in the 4 groups were compared. A：ear red appearance time；B：ear red disappearance time.Mean±SD.n=12.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.图2 4组大鼠耳红出现时间和耳红消失时间比较

2 TSPN对大鼠脑组织神经元的影响

对照组脑组织神经元染色均匀，细胞未肿胀、坏死；模型组神经元出现明显空泡状，细胞萎缩、坏死严重，出现局部坏死、血管阻塞现象；TSPN 组神经元损伤得到一定修复，神经元仅存在部分空泡现象；TSPN+抑制剂组细胞空泡现象明显，出现部分血管阻塞现象，见图3。

Figure 3. Neurons in brain tissues of the rats in the 4 groups（HE staining，scale bar=100 μm）. A：control group；B：model group；C：TSPN group；D：TSPN+inhibitor group. Long arrow：vascular obstruction；short arrow：atrophic cells；H：local necrosis；V：vacuole cells. Obvious vacuoles，cell atrophy，severe necrosis，local necrosis，and blood vessel obstruction were observed in model group. Partial vacuolation was observed in TSPN group. Cellular vacuolation was obvious in TSPN+inhibitor group.图3 4组大鼠脑组织神经元形态

3 TSPN 对大鼠血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平的影响

与对照组相比，模型组和TSPN+抑制剂组血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平，以及TSPN 组血清中NO 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，TSPN 组血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平，以及TSPN+抑制剂组血清中IL-6 和IL-1β 水平显著降低（P＜0.05）；与TSPN 组相比，TSPN+抑制剂组血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平显著升高（P＜0.05），见图4。

Figure 4. The levels of NO，IL-6 and IL-1β in serum of the rats in the 4 groups were compared. A：NO level in serum；B：IL-6 level in serum；C：IL-1β level in serum. Mean±SD.n=12.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.图4 4组大鼠血清中NO、IL-6和IL-1β水平比较

4 TSPN 对大鼠脑组织中5-HT、β-EP 和CGRP 含量的影响

与对照组相比，模型组脑组织中5-HT和β-EP含量，以及TSPN+抑制剂组脑组织中5-HT 含量显著降低（P＜0.05），TSPN 组脑组织中β-EP 含量，以及模型组、TSPN 组和TSPN+抑制剂组脑组织中CGRP 含量显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，TSPN 组脑组织中5-HT和β-EP含量，以及TSPN+抑制剂组脑组织中β-EP 含量显著升高（P＜0.05），TSPN 组和TSPN+抑制剂组脑组织中CGRP 含量显著降低（P＜0.05）；与TSPN 组相比，TSPN+抑制剂组脑组织中5-HT 和β-EP含量显著降低（P＜0.05），CGRP含量显著升高（P＜0.05），见图5。

Figure 5. Comparison of the contents of 5-HT，β-EP and CGRP in brain tissues of the rats in the 4 groups. A：5-HT content in brain tissue；B：β-EP content in brain tissue；C：CGRP content in brain tissue. Mean±SD.n=6*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.图5 4组大鼠脑组织中5-HT、β-EP和CGRP含量比较

5 TSPN 对大鼠脑组织中NRG1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、caspase-3 和cleaved caspase-3 蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组和TSPN+抑制剂组脑组织中NRG1、ErbB2、ErbB3 和ErbB4 蛋白水平，以及TSPN 组脑组织中ErbB2、ErbB3 和ErbB4 蛋白水平显著降低（P＜0.05），模型组和TSPN+抑制剂组脑组织中cleaved caspase-3/caspase-3蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，TSPN 组脑组织中NRG1、ErbB2、ErbB3 和ErbB4 蛋白水平，以及TSPN+抑制剂组脑组织中NRG1 蛋白水平显著升高（P＜0.05），TSPN 组和TSPN+抑制剂组脑组织中cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平显著降低（P＜0.05）；与TSPN 组相比，TSPN+抑制剂组脑组织中NRG1、ErbB2、ErbB3和ErbB4 蛋白水平显著降低（P＜0.05），cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图6。

Figure 6. The protein levels of NRG1，ErbB2，ErbB3，ErbB4，caspase-3 and cleaved caspase-3 in brain tissues of the rats in the 4 groups. Mean±SD.n=6.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.图6 4组大鼠脑组织中NRG1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平情况

讨论

偏头痛中医属“头风”、“头痛”、“厥头痛”等范畴，表现为感受外邪、情至内伤、饮食不节、久病至淤所致肝、脾、肾失常，导致痰淤阻络［9］。本研究中，偏头痛大鼠出现耳红、爬笼、挠头、咬尾、往返运动增加，提示大鼠出现不适症状。TSPN 在神经保护方面研究成为热点，可缓解神经元损伤［10］，在麻醉药七氟醚致神经元损害中，TSPN 可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡进而缓解七氟醚导致的神经细胞凋亡、学习和记忆障碍现象，实现对机体的保护［11］。TSPN 治疗偏头痛后大鼠耳红、爬笼、挠头、咬尾、往返运动症状均有所减轻，耳红出现时间延后、耳红消退时间提前，提示TSPN 能够缓解偏头痛造成的不适症状。HE 染色检测，偏头痛大鼠脑组织出现明显的神经元坏死、空泡现象；经TSPN 治疗后，脑组织神经元损伤现象得到一定缓解，提示TSPN 可能缓解神经元损伤实现对偏头痛大鼠的保护。

在本研究用硝酸甘油诱导大鼠制备偏头痛模型，硝酸甘油作为NO 供体，在体内可直接作用于血管平滑肌细胞生成NO，增加血液中NO 含量［12］；硝酸甘油也可刺激神经末梢释放CGRP，CGRP 在外周血中浓度增加会诱发血管扩张和脑膜肥大细胞脱颗粒，进而释放神经组织血管活性物质，包括IL-6 和IL-1β等，诱发神经源性炎症偏头痛［13］。5-HT在偏头痛发作期水平降低，可引起血管扩张性疼痛，临床上多种头痛药通过激活5-HT 发挥作用［14］。β-EP 在疼痛应激下可释放入血，抑制P 物质的释放，从而使神经疼痛感觉抑制［15］。本研究显示，模型组血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平，以及脑组织中CGRP 含量升高，脑组织中5-HT和β-EP含量降低。这提示大鼠受硝酸甘油刺激，生成NO，增加血液中NO 含量；同时刺激CGRP 的生成，CGRP 水平升高诱发血管扩张和脑膜肥大细胞脱颗粒，促进IL-6 和IL-1β 的升高，诱发炎症偏头痛；偏头痛发生后神经递质5-HT和β-EP含量降低，增加痛感，导致大鼠出现不适症状。经TSPN 治疗后，血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平，以及脑组织中CGRP 含量降低，脑组织中5-HT 和β-EP 含量升高，提示TSPN 能够缓解硝酸甘油造成的大鼠炎症性偏头痛，减少大鼠痛感，实现对疾病的保护。

NRG 可作为配体结合于细胞表面ErbB 受体，引起原有构象发生改变，进而影响下游信号通路的变化，进而调节神经细胞［16］。NRG 中NRG1 研究较广泛，ErbB 在脑中神经元胞体中可见ErbB2、ErbB3 和ErbB4。另有研究显示，NRG/ErbB 通路具有抗凋亡作用，能够抑制caspase-3的活化，实现对神经干细胞凋亡的缓解［17］；能够抑制巨噬细胞的浸润，阻断巨噬细胞和小胶质细胞表达促炎因子［18］。在本研究中，模型组NRG1、ErbB2、ErbB3和ErbB4蛋白水平降低，cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平升高，提示NRG/ErbB 通路蛋白在偏头痛脑组织中表达降低，对神经元的保护作用减弱，导致炎症损伤加剧、神经元凋亡严重。经TSPN 治疗后，NRG/ErbB 通路处于激活状态，cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平降低；在TSPN 治疗基础上添加抑制剂AG825，虽然AG825作为ErbB2 的特异性抑制剂，但ErbB2 受NRG 刺激发挥作用，会促进cleaved caspase-3/caspase-3、炎症因子IL-6 和IL-1β 水平升高，提示TSPN 能够通过激活NRG/ErbB通路实现对炎症、细胞凋亡的缓解。

综上所述，TSPN 通过激活NRG/ErbB 通路实现对偏头痛大鼠的保护，可能与抑制炎症、抑制神经元凋亡有关，为TSPN 在临床上治疗偏头痛提供一定动物实验参考依据。