IL-10调节日本血吸虫感染小鼠肝脏炎症和纤维化的实验观察

2021-11-10 03:29金郁刘道华金伟呼明闯汪奇志
热带病与寄生虫学 2021年5期
关键词:血吸虫单核细胞纤维化

金郁,刘道华,金伟,呼明闯,汪奇志

安徽省血吸虫病防治研究所,安徽 合肥 230601

日本血吸虫感染宿主后,沉积在肝脏的虫卵会招募许多免疫细胞(如T细胞、B细胞、髓系细胞等)至肝脏中,分泌促炎和促纤维化因子,持续的炎症反应会导致肝脏纤维化。在血吸虫感染小鼠的早期,外周Ly6Chi单核细胞依靠CCL2-CCR2、CCL1-CCR8、CCL3/4/5-CCR1/5、CXCL10-CXCR3等趋化因子及其受体相互作用浸润至肝脏[1-4],Ly6Chi单核细胞发育成Ly6Chi巨噬细胞,加重炎症和肝损伤;Ly6Chi巨噬细胞在后期会转化为Ly6Clo巨噬细胞,分泌基质金属蛋白酶、生长因子、吞噬相关蛋白等组织修复因子,起到修复组织的作用[5]。

小鼠体内B细胞分为B1a、B1b和B2三个细胞亚群,其中B1细胞可以分泌IL-10。IL-10在负调节免疫应答方面发挥着重要作用,是一种重要的免疫调节因子。IL-10可以通过多种机制来介导炎症的负调节,如维持调节性T细胞的抑制功能、限制促炎细胞因子IFN-γ和IL-17的产生、下调MHCⅡ的表达等[6-7]。在肾纤维化中,IL-10缺陷型小鼠在单侧输尿管梗塞发病后,观察到更加严重的肾脏炎症和纤维化,炎性细胞浸润增多,细胞因子MCP-1、RANTES、TNF-α、IL-6、IL-8、MCF上调[8],表明IL-10在多种器官纤维中发挥着免疫调节作用,其在日本血吸虫病肝纤维化的作用值得深入研究。本文利用日本血吸虫感染小鼠模型,通过观察IL-10R阻断后小鼠的肝脏炎症及纤维化发展,探究IL-10在日本血吸虫感染急性期的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 8~10周雌性野生型C57BL/6小鼠购自安徽医科大学实验动物中心,SPF级实验室饲养。

1.1.2主要仪器与试剂 离心机、流式细胞仪、酶标仪分别为美国Beckman公司、BD公司和Bio Tek 公司产品。小鼠IL-6、IL-12 p40、TNF-α ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司;小鼠CCL2、CCL3、CCL4、CCL5 Flex Set和CBA Mouse Soluble Protein Maser Buffer Kit试剂盒购自美国BD公司;ALT检测试盒购自南京建成公司;PCR试剂盒购自日本TAKARA公司;IL-10R阻断单克隆抗体和大鼠免疫球蛋白G1(Rat IgG1)购自北京安诺伦生物技术公司。

1.2方法

1.2.1日本血吸虫感染小鼠模型的建立及实验分组 采用腹部贴片法感染30只小鼠,每只感染18~20条日本血吸虫尾蚴。于小鼠感染后第2 d开始,随机分为数量相等的2组,实验组每2周腹腔注射1次IL-10R阻断单克隆抗体,每只鼠每次注射250 μg,共注射3次,对照组相同方法注射Rat IgG1;于感染后第6周处死小鼠,眼球取血,将血液室温静置30 min后离心10 min(1 200×g,4 ℃)进行血清分离、收集;同时收集肝脏样本用于后续实验。

1.2.2谷丙转氨酶(ALT)检测 根据说明书进行操作,检测实验组和对照组小鼠血清ALT水平。

1.2.3苏木精-伊红(HE)和天狼星红染色 肝脏样本进行组织脱水、石蜡包埋、制成5μm切片,脱蜡至水。HE染色:苏木精染色8 min,将肝脏样本胞核变蓝为止;伊红染色3 s,流水冲洗5 min;烘干,中性树脂封片。天狼星红染色:天狼星红染料染色30 min,流水冲洗5 min,烘干,封片。

1.2.4小鼠肝脏免疫细胞分离 剪碎小鼠肝脏样本,加入0.05%消化液放置摇床上,37 ℃,200 rpm,消化60 min;补满1×PBS终止消化后 200目筛网过滤;离心,50×g,2 min,4 ℃,2~3次,去除肝实质细胞;留上清,500×g,10 min,4 ℃,收集细胞沉淀,用1×PBS洗1次,收集细胞沉淀;加入40% Percoll重悬细胞沉淀并将细胞悬液转至离心管中,1 260×g,30 min,20 ℃;吸除上层所有液体,收集细胞沉淀;加入1×ACK裂解红细胞,冰上裂解红细胞5 min,用1×PBS洗1次,收集细胞;将得到的细胞分离,制成单细胞悬液,3%冰醋酸适当稀释,用细胞计数板在低倍镜下计数,计算出相应的细胞数。

1.2.5流式细胞术检测细胞表面marker 制备单细胞悬液:收集细胞,用1×PBS洗1次,调整细胞数至1×106/100 μL。封闭Fc受体:加入5 μL正常大鼠血清,混匀,4 ℃孵育30 min。标记抗体:加入相应预混的抗体(PE/Cy7-CD45、PerCP/Cy5.5-F4/80、PE-CD11b、FITC-Ly6C),混匀,4 ℃避光孵育30 min。洗涤后检测:用Wash Buffer洗涤2次后,加入200 μL 1×PBS重悬细胞,流式细胞仪检测。

1.2.6RNA提取、逆转录及定量PCR 取适量肝脏组织,加入1 mL Trizol,匀浆机匀浆后,根据产品说明书进行RNA提取;提取的RNA逆转录成cDNA,参照文献[9],引物序列如表1。

表1 不同基因引物序列

1.2.7相关因子检测 肝脏匀浆后,离心取上清,采用ELISA试剂盒检测小鼠肝脏局部IL-6、IL-12 p40、TNF-α,CBA及Flex Set试剂盒检测CCL2、CCL3、CCL4、CCL5,根据产品说明书进行操作。

1.3统计分析 应用SPSS 20.0统计软件,利用两侧不配对的t检验进行统计学分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1小鼠肝脏肉芽肿和血清ALT变化 实验组小鼠肝脏单个虫卵肉芽肿较对照组增大(t=4.817,P<0.05),胶原沉积更多(图1A和1B),且血清ALT水平更高(t=5.505,P<0.05)(图1C)。

注:A为HE和天狼星红染色;B为单个肉芽肿大小统计;C为血清ALT检测。**表示P<0.01。

2.2小鼠肝脏巨噬细胞和相关因子变化 流式细胞术检测发现,实验组小鼠肝脏驻留的巨噬细胞(枯否细胞,KCs)在IL-10R被阻断后细胞比例和数目均显著增多(t=18.85、3.19,P均<0.05);促炎性Ly6Chi巨噬细胞比例增多(t=27.63,P<0.05),细胞数目无变化(t=3.92,P>0.05);而修复性Ly6Clo巨噬细胞比例及数目均显著减少(t=17.87、25.69,P均<0.05)(图2)。

注:A为典型流式图,KCs:F4/80hi CD11bint,外周浸润的巨噬细胞:F4/80int CD11bhi;B为细胞比例统计;C为细胞数目统计。**表示P<0.01。

实验组小鼠肝脏CCL2、CCL3、CCL4、CCL5的mRNA表达较对照组升高(t=19.85、15.79、37.79、28.94,P均<0.05),CCL2、CCL3的蛋白含量也升高(t=2.308、2.619,P均<0.05);此外,TNF-α、IL-1b、IL-6、IL-12a、IL-12b的mRNA相比于对照组表达量增多(t=90.42、26.75、123.9、46.18、4.687,P均<0.05),TNF-α的蛋白含量升高(t=36.29,P<0.05)(图3)。

注:A为定量PCR检测的mRNA水平;B为ELISA和CBA检测的蛋白水平。*表示P<0.05,**表示P<0.01。

3 讨 论

IL-10在免疫应答方面发挥重要的负调节作用,所以在多种器官纤维化中发挥着免疫调节作用。有实验观察到吸入二氧化硅的小鼠肺和支气管肺泡灌洗液中IL-10显著增多,说明IL-10与肺纤维化有紧密的联系,IL-10缺陷型小鼠经二氧化硅气管滴注后,观察到更加严重的肺部炎症[10]。Rodell等用透明质酸水凝胶包裹IL-10,对肾纤维化组织进行局部免疫治疗后,肾脏巨噬细胞的浸润、凋亡的细胞、纤维化区域都明显降低[11-12]。CCl4诱导的IL-10缺陷型小鼠肝纤维化中,检测到更高的TNF-α水平和更加严重的肝纤维化[13-14]。本研究在日本血吸虫感染小鼠的模型中,使用IL-10R阻断抗体处理感染的小鼠后,发现肝脏促炎性巨噬细胞和炎性因子显著增多,肝脏炎症加重;天狼星红染色显示IL-10R阻断抗体处理的感染小鼠肝脏胶原沉积增多,提示IL-10可能与血吸虫病肝脏纤维化有关。

当肝脏受到损伤,肝脏内枯否细胞和肝星状细胞活化,分泌趋化因子如CCL2,会招募大量的Ly6Chi单核细胞转移至肝脏中,随后发育为促炎型Ly6Chi单核细胞来源的巨噬细胞。肝脏促炎性Ly6Chi巨噬细胞具有很强的促炎表型,表达多种炎性趋化因子和细胞因子,是加重肝损伤的“罪魁祸首”[15-16],在MCD和CCl4诱导小鼠肝纤维化模型中,Ly6Chi单核细胞在前期浸润至肝脏中发育成熟为Ly6Chi巨噬细胞,释放促炎和促纤维化因子,促进了炎症反应、肝损伤和肝纤维化[17-20]。本研究发现,在小鼠血吸虫病肝纤维化模型中阻断IL-10R后,小鼠肝脏中的趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5表达量相较对照组增高,说明当IL-10缺失后,对CCL2、CCL3、CCL4、CCL5表达限制的降低,失去了对Ly6Chi单核细胞的浸润至肝脏的抑制,表现出肝脏促炎性Ly6Chi巨噬细胞显著增多,导致肝脏胶原沉积增多,说明IL-10可能是通过调控Ly6Chi巨噬细胞数量来调节肝脏炎症反应。同时有研究表明,TNF-α和IL-6可以直接活化肝脏星形细胞,获得星形胶质细胞生成细胞外基质,大量细胞外基质沉积则引起肝纤维化。本研究实验结果表明IL-10R会限制炎性细胞因子(TNF-α、IL-1b、IL-6、IL-12a、IL-12b)的表达,同时会降低TNF-α的表达,说明IL-10可以通过限制TNF-α和IL-6的表达,进而对血吸虫病早期的肝脏炎症及后期发展的肝纤维化产生影响。

综上,本研究间接证明了IL-10可能通过调节趋化因子的表达,抑制了Ly6Chi巨噬细胞向肝脏的浸润,减少了炎性细胞释放促炎和促纤维化因子,对肝纤维化产生影响。但是由于肝脏免疫微环境的复杂网络调控,不排除Ly6Chi单核细胞可能会受到其他免疫细胞的影响,因此具体调控机制有待进一步研究。

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