IL-10调节日本血吸虫感染小鼠肝脏炎症和纤维化的实验观察

金郁，刘道华，金伟，呼明闯，汪奇志

安徽省血吸虫病防治研究所，安徽 合肥 230601

日本血吸虫感染宿主后，沉积在肝脏的虫卵会招募许多免疫细胞(如T细胞、B细胞、髓系细胞等)至肝脏中，分泌促炎和促纤维化因子，持续的炎症反应会导致肝脏纤维化。在血吸虫感染小鼠的早期，外周Ly6Chi单核细胞依靠CCL2-CCR2、CCL1-CCR8、CCL3/4/5-CCR1/5、CXCL10-CXCR3等趋化因子及其受体相互作用浸润至肝脏[1-4]，Ly6Chi单核细胞发育成Ly6Chi巨噬细胞，加重炎症和肝损伤；Ly6Chi巨噬细胞在后期会转化为Ly6Clo巨噬细胞，分泌基质金属蛋白酶、生长因子、吞噬相关蛋白等组织修复因子，起到修复组织的作用[5]。

小鼠体内B细胞分为B1a、B1b和B2三个细胞亚群，其中B1细胞可以分泌IL-10。IL-10在负调节免疫应答方面发挥着重要作用，是一种重要的免疫调节因子。IL-10可以通过多种机制来介导炎症的负调节，如维持调节性T细胞的抑制功能、限制促炎细胞因子IFN-γ和IL-17的产生、下调MHCⅡ的表达等[6-7]。在肾纤维化中，IL-10缺陷型小鼠在单侧输尿管梗塞发病后，观察到更加严重的肾脏炎症和纤维化，炎性细胞浸润增多，细胞因子MCP-1、RANTES、TNF-α、IL-6、IL-8、MCF上调[8]，表明IL-10在多种器官纤维中发挥着免疫调节作用，其在日本血吸虫病肝纤维化的作用值得深入研究。本文利用日本血吸虫感染小鼠模型，通过观察IL-10R阻断后小鼠的肝脏炎症及纤维化发展，探究IL-10在日本血吸虫感染急性期的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 8～10周雌性野生型C57BL/6小鼠购自安徽医科大学实验动物中心，SPF级实验室饲养。

1.1.2主要仪器与试剂 离心机、流式细胞仪、酶标仪分别为美国Beckman公司、BD公司和Bio Tek 公司产品。小鼠IL-6、IL-12 p40、TNF-α ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司；小鼠CCL2、CCL3、CCL4、CCL5 Flex Set和CBA Mouse Soluble Protein Maser Buffer Kit试剂盒购自美国BD公司；ALT检测试盒购自南京建成公司；PCR试剂盒购自日本TAKARA公司；IL-10R阻断单克隆抗体和大鼠免疫球蛋白G1(Rat IgG1)购自北京安诺伦生物技术公司。

1.2方法

1.2.1日本血吸虫感染小鼠模型的建立及实验分组 采用腹部贴片法感染30只小鼠，每只感染18～20条日本血吸虫尾蚴。于小鼠感染后第2 d开始，随机分为数量相等的2组，实验组每2周腹腔注射1次IL-10R阻断单克隆抗体，每只鼠每次注射250 μg，共注射3次，对照组相同方法注射Rat IgG1；于感染后第6周处死小鼠，眼球取血，将血液室温静置30 min后离心10 min(1 200×g，4 ℃)进行血清分离、收集；同时收集肝脏样本用于后续实验。

1.2.2谷丙转氨酶(ALT)检测 根据说明书进行操作，检测实验组和对照组小鼠血清ALT水平。

1.2.3苏木精-伊红(HE)和天狼星红染色 肝脏样本进行组织脱水、石蜡包埋、制成5μm切片，脱蜡至水。HE染色：苏木精染色8 min，将肝脏样本胞核变蓝为止；伊红染色3 s，流水冲洗5 min；烘干，中性树脂封片。天狼星红染色：天狼星红染料染色30 min，流水冲洗5 min，烘干，封片。

1.2.4小鼠肝脏免疫细胞分离 剪碎小鼠肝脏样本，加入0.05%消化液放置摇床上，37 ℃，200 rpm，消化60 min；补满1×PBS终止消化后 200目筛网过滤；离心，50×g，2 min，4 ℃，2～3次，去除肝实质细胞；留上清，500×g，10 min，4 ℃，收集细胞沉淀，用1×PBS洗1次，收集细胞沉淀；加入40% Percoll重悬细胞沉淀并将细胞悬液转至离心管中，1 260×g，30 min，20 ℃；吸除上层所有液体，收集细胞沉淀；加入1×ACK裂解红细胞，冰上裂解红细胞5 min，用1×PBS洗1次，收集细胞；将得到的细胞分离，制成单细胞悬液，3%冰醋酸适当稀释，用细胞计数板在低倍镜下计数，计算出相应的细胞数。

1.2.5流式细胞术检测细胞表面marker 制备单细胞悬液：收集细胞，用1×PBS洗1次，调整细胞数至1×106/100 μL。封闭Fc受体：加入5 μL正常大鼠血清，混匀，4 ℃孵育30 min。标记抗体：加入相应预混的抗体(PE/Cy7-CD45、PerCP/Cy5.5-F4/80、PE-CD11b、FITC-Ly6C)，混匀，4 ℃避光孵育30 min。洗涤后检测：用Wash Buffer洗涤2次后，加入200 μL 1×PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。

1.2.6RNA提取、逆转录及定量PCR 取适量肝脏组织，加入1 mL Trizol，匀浆机匀浆后，根据产品说明书进行RNA提取；提取的RNA逆转录成cDNA，参照文献[9]，引物序列如表1。

表1 不同基因引物序列

1.2.7相关因子检测 肝脏匀浆后，离心取上清，采用ELISA试剂盒检测小鼠肝脏局部IL-6、IL-12 p40、TNF-α，CBA及Flex Set试剂盒检测CCL2、CCL3、CCL4、CCL5，根据产品说明书进行操作。

1.3统计分析 应用SPSS 20.0统计软件，利用两侧不配对的t检验进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1小鼠肝脏肉芽肿和血清ALT变化 实验组小鼠肝脏单个虫卵肉芽肿较对照组增大(t=4.817,P<0.05)，胶原沉积更多(图1A和1B)，且血清ALT水平更高(t=5.505,P<0.05)(图1C)。

注：A为HE和天狼星红染色；B为单个肉芽肿大小统计；C为血清ALT检测。**表示P<0.01。

2.2小鼠肝脏巨噬细胞和相关因子变化 流式细胞术检测发现，实验组小鼠肝脏驻留的巨噬细胞(枯否细胞，KCs)在IL-10R被阻断后细胞比例和数目均显著增多(t=18.85、3.19，P均<0.05)；促炎性Ly6Chi巨噬细胞比例增多(t=27.63，P<0.05)，细胞数目无变化(t=3.92，P>0.05)；而修复性Ly6Clo巨噬细胞比例及数目均显著减少(t=17.87、25.69，P均<0.05)(图2)。

注：A为典型流式图，KCs：F4/80hi CD11bint，外周浸润的巨噬细胞：F4/80int CD11bhi；B为细胞比例统计；C为细胞数目统计。**表示P<0.01。

实验组小鼠肝脏CCL2、CCL3、CCL4、CCL5的mRNA表达较对照组升高(t=19.85、15.79、37.79、28.94，P均<0.05)，CCL2、CCL3的蛋白含量也升高(t=2.308、2.619，P均<0.05)；此外，TNF-α、IL-1b、IL-6、IL-12a、IL-12b的mRNA相比于对照组表达量增多(t=90.42、26.75、123.9、46.18、4.687，P均<0.05)，TNF-α的蛋白含量升高(t=36.29，P<0.05)(图3)。

注：A为定量PCR检测的mRNA水平；B为ELISA和CBA检测的蛋白水平。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

3 讨 论

IL-10在免疫应答方面发挥重要的负调节作用，所以在多种器官纤维化中发挥着免疫调节作用。有实验观察到吸入二氧化硅的小鼠肺和支气管肺泡灌洗液中IL-10显著增多，说明IL-10与肺纤维化有紧密的联系,IL-10缺陷型小鼠经二氧化硅气管滴注后，观察到更加严重的肺部炎症[10]。Rodell等用透明质酸水凝胶包裹IL-10，对肾纤维化组织进行局部免疫治疗后，肾脏巨噬细胞的浸润、凋亡的细胞、纤维化区域都明显降低[11-12]。CCl4诱导的IL-10缺陷型小鼠肝纤维化中，检测到更高的TNF-α水平和更加严重的肝纤维化[13-14]。本研究在日本血吸虫感染小鼠的模型中，使用IL-10R阻断抗体处理感染的小鼠后，发现肝脏促炎性巨噬细胞和炎性因子显著增多，肝脏炎症加重；天狼星红染色显示IL-10R阻断抗体处理的感染小鼠肝脏胶原沉积增多，提示IL-10可能与血吸虫病肝脏纤维化有关。

当肝脏受到损伤，肝脏内枯否细胞和肝星状细胞活化，分泌趋化因子如CCL2，会招募大量的Ly6Chi单核细胞转移至肝脏中，随后发育为促炎型Ly6Chi单核细胞来源的巨噬细胞。肝脏促炎性Ly6Chi巨噬细胞具有很强的促炎表型，表达多种炎性趋化因子和细胞因子，是加重肝损伤的“罪魁祸首”[15-16]，在MCD和CCl4诱导小鼠肝纤维化模型中，Ly6Chi单核细胞在前期浸润至肝脏中发育成熟为Ly6Chi巨噬细胞，释放促炎和促纤维化因子，促进了炎症反应、肝损伤和肝纤维化[17-20]。本研究发现,在小鼠血吸虫病肝纤维化模型中阻断IL-10R后，小鼠肝脏中的趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5表达量相较对照组增高，说明当IL-10缺失后，对CCL2、CCL3、CCL4、CCL5表达限制的降低，失去了对Ly6Chi单核细胞的浸润至肝脏的抑制，表现出肝脏促炎性Ly6Chi巨噬细胞显著增多，导致肝脏胶原沉积增多，说明IL-10可能是通过调控Ly6Chi巨噬细胞数量来调节肝脏炎症反应。同时有研究表明，TNF-α和IL-6可以直接活化肝脏星形细胞，获得星形胶质细胞生成细胞外基质，大量细胞外基质沉积则引起肝纤维化。本研究实验结果表明IL-10R会限制炎性细胞因子(TNF-α、IL-1b、IL-6、IL-12a、IL-12b)的表达，同时会降低TNF-α的表达，说明IL-10可以通过限制TNF-α和IL-6的表达，进而对血吸虫病早期的肝脏炎症及后期发展的肝纤维化产生影响。

综上，本研究间接证明了IL-10可能通过调节趋化因子的表达，抑制了Ly6Chi巨噬细胞向肝脏的浸润，减少了炎性细胞释放促炎和促纤维化因子，对肝纤维化产生影响。但是由于肝脏免疫微环境的复杂网络调控，不排除Ly6Chi单核细胞可能会受到其他免疫细胞的影响，因此具体调控机制有待进一步研究。