我国乙型脑炎病毒优势基因型转换及其风险和对策

苑中芬，狄荻，李宗杰，魏建超

1.莒县疾病预防控制中心，山东 日照 276599；2.中国农业科学院上海兽医研究所

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一种人畜共患病，主要流行于东亚、东南亚和南亚地区，被WHO列为重点控制的传染病[1]。1871年，日本记录了第一例乙型脑炎病例。1924年，日本出现的临床病例超过6 000人，死亡率约为60%，科学家首次在病人脑组织中分离到了病原。1935年，Nakayama毒株被分离并确定为乙型脑炎病毒[2]。1940年，中国报道了首例乙型脑炎病例。2003—2018年，中国先后报告了51 013例乙型脑炎病例[3]。目前，全世界每年约有3万～5万人感染乙型脑炎病毒，死亡人数约1万～1.5万人，部分感染患者恢复后也会留下严重的神经性后遗症[4-5]。因此，乙型脑炎病毒已经对人类和动物生命健康带来了巨大的威胁，如何采取有效的措施防控流行性乙型脑炎已经成了公共卫生领域面临的重要课题。

乙型脑炎病毒只有一个血清型，根据基因组序列特征可分为5个基因型(GⅠ-GⅤ型)。其中GⅠ-a型毒株多分布于热带，GⅠ-b型毒株在温带地区更常见；GⅡ型毒株更偏好于热带地区；GⅢ型毒株主要分布在日本、中国、菲律宾、斯里兰卡和印度;GⅣ型毒株局限在印度尼西亚地区;GⅤ型仅在马来西亚、中国和韩国有报道[6]。我国共分离到三种基因型(GⅠ型、GⅢ型和GⅤ型)，其中GⅠ型主要分布在天津、甘肃、山东、浙江、江西、安徽、湖南，而新疆、黑龙江、北京以GⅢ型为主，江苏、山西、四川、辽宁、云南、广西、湖北、河南、贵州、福建、上海、重庆、台湾、广东是GⅠ型和GⅢ型的混合流行区[7]。20世纪30年代以来，GⅢ型毒株一直占据着亚洲地区乙型脑炎病毒流行的主要地位。但是，最近二十年的研究发现GⅠ型毒株逐渐替代GⅢ型毒株，成为我国乃至整个亚洲地区的主要流行毒株[8]。因此，研究乙型脑炎病毒基因型转换趋势对于防控乙型脑炎具有重要意义。

近年来，随着各种乙型脑炎疫苗的接种率逐渐提高，乙型脑炎病毒的传播与流行已经获得较好的控制。但是，随着乙型脑炎病毒优势基因型由GⅢ型向GⅠ型转变，相关疫苗的升级换代也迫在眉睫[9]。此外，研究已经证实三带喙库蚊是乙型脑炎病毒的传播媒介，猪和鹭科水鸟都是乙型脑炎病毒的增殖宿主[10]。因此，加强控制和消灭媒介昆虫也是建立完善乙型脑炎防控体系的重要举措[11]。

本文主要综述了乙型脑炎病毒的病原学特征、感染宿主的病理机制、优势基因型转换趋势及其风险分析，并且对乙型脑炎的防控对策提出了新的见解。

1 乙型脑炎病毒的病原学特征

乙型脑炎病毒是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组长度约为11 kb，和登革病毒(dengue virus，DENV)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)和蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus，TBEV)等都是黄病毒属的成员[12]。乙型脑炎病毒颗粒的外观呈现为约50 nm大小二十面体对称的球形结构，外层由脂质囊膜包裹，内层含有一个约30 nm高电子密度的核[13]。乙型脑炎病毒的基因组包含一个单一的开放阅读框(open reading frames，ORF)，编码蛋白被蛋白酶切割后可产生三个结构蛋白和七个非结构蛋白[14-15]。其中结构蛋白是构成病毒粒子的重要组分，而非结构蛋白则在病毒的复制、组装和逃避宿主的天然免疫反应中发挥关键作用[16-17]。

2 乙型脑炎病毒感染宿主的病理机制

乙型脑炎病毒感染人之后存在5～15天的潜伏期，主要症状表现为非特异性发热和无菌性脑膜炎或脑炎，引起相应的急性症状主要包括神经源性呼吸缺乏、心血管休克和恶心等[18]。此外，脊髓运动神经元也可能会受到影响，导致出现急性弛缓性麻痹[19]。在致死性的病例中，大脑会出现血管充血、小胶质细胞增生、胶质细胞间质形成结节、局灶性囊性坏死、脑水肿等多种病理变化[20]。乙型脑炎的流行不仅严重危害人类健康，同时也造成巨大社会负担和经济负担。

乙型脑炎病毒主要通过入侵人、猪、马和野生动物脑神经,增加炎症因子和趋化因子并募集外周免疫细胞，在中枢神经系统中诱发“炎症风暴”并最终导致神经元死亡[21]。乙型脑炎病毒增殖时，单股正链RNA病毒既可以直接复制子代RNA，又可以发挥mRNA作用翻译出病毒蛋白。核衣壳蛋白(C蛋白)主要参与病毒基因组的组装和核衣壳的形成，膜蛋白(M蛋白)参与病毒颗粒装配和释放，囊膜糖蛋白(E蛋白)是与细胞膜受体相结合并且使病毒进入细胞的主要蛋白，与病毒的吸附、侵入、致病性以及诱导宿主的免疫应答等密切相关[22]。E蛋白具有三个结构不同的结构域(DⅠ、DⅡ和DⅢ)，其中DⅠ区与E蛋白的结构重排有关，DⅡ区可影响病毒与宿主细胞之间的膜融合，DⅢ区具有与受体结合的氨基酸位点，在与宿主细胞受体相互作用和促进病毒进入宿主细胞过程中发挥重要作用[23]。7种非结构蛋白中的NS1蛋白在病毒复制过程中起着辅助因子作用，NS2A、NS4A和NS4B具有干扰素拮抗作用，NS2B和NS3具有蛋白酶活性，NS5蛋白可抑制干扰素诱导的免疫应答过程[24]。研究乙型脑炎病毒的致病机制有助于深入了解其病毒变异的生物学特性。

3 乙型脑炎优势基因型的变化

乙型脑炎病毒的主要传播基因型可能会发生周期性变化，具体原因很有可能与蚊子-禽-蚊子传播周期中GⅠ型毒株在禽类宿主中具有更高的病毒血症和更长的持续时间有关[25-27]。与GⅢ型毒株相比较，GⅠ型毒株在禽类宿主中诱导的干扰素表达更低，从而表现出对禽类宿主的适应性优势。通过构建嵌合病毒与定点突变病毒，发现NS5-V372A-H386Y两个氨基酸位点的氢键排布导致了对宿主适应性的差异[9]。此外，我国学者还从库蚊中分离得到了GⅤ型毒株，而且其生物学特性和致病性与GⅠ型毒株和GⅢ型毒株显著不同[28]。GⅤ型毒株的核苷酸序列与GⅠ-Ⅳ型毒株的同源性不高，GⅤ型毒株的NS4A基因中多插入了3个核苷酸，在终止密码子下游的非翻译区域也有核苷酸插入，并且E基因有多个氨基酸发生突变(约10%)。因此，GⅤ型毒株的编码区和非编码区的基因突变决定了其具有更强的毒力和更高的致病性[29]。通过比较不同毒株的E蛋白序列，发现E蛋白138位氨基酸残基(E138)的酸碱性能够决定乙型脑炎病毒的神经毒力，强酸性氨基酸毒力强，弱酸性氨基酸则毒力呈现部分下降，而强碱性毒力弱。进一步研究发现强毒株能在脑内扩散，弱毒株则失去脑内扩散能力。因此，E138可作为强、弱毒株筛选鉴定的重要标志，同时也可作为判断E138突变的JEV疫苗是否出现毒力返强的靶位点[30]。

4 乙型脑炎病毒优势基因型转换的风险分析

分子流行病学监测表明，我国乙型脑炎病毒的优势基因型已从GⅢ型逐渐向GⅠ型转变，同时西藏地区还出现了毒力更强和致病性更高的GⅤ型毒株。乙型脑炎病毒的优势基因型转换导致了更加严峻的传播风险，给公共卫生领域的防控工作带来了新的挑战[31-32]。由于目前世界上尚无可用于治疗乙型脑炎病毒感染的特定药物，因此通过广泛接种疫苗进行免疫预防是控制乙型脑炎病毒传播的有效方法。我国目前使用的两种乙型脑炎疫苗(SA14-14-2弱毒活疫苗和灭活的P3毒株疫苗)均源自GⅢ型毒株，其对GⅠ型和GⅤ型毒株攻击的保护效果值得进一步评估[33]。通过病毒中和试验研究发现，GⅢ型毒株疫苗诱导产生的中和抗体对GⅠ型毒株的中和能力明显降低[34]。此外，研究发现GⅢ型毒株疫苗对于GⅤ型毒株的攻击也不能提供完全保护[35]。只有针对病毒流行优势基因型研发有效的保护疫苗，才能有效控制多种基因型共同流行的现状。

目前，全球有4种不同类型的乙型脑炎疫苗可供使用：①鼠脑灭活疫苗；②细胞来源的弱毒活苗；③细胞来源的灭活疫苗；④基因工程的弱毒嵌合活疫苗。中国农业科学院上海兽医研究所马志永课题组通过攻毒保护实验对不同GⅢ型和GⅠ型毒株衍生疫苗的交叉保护作用进行了大量研究，结果表明接种了GⅢ型毒株疫苗(SA14-14-2弱毒活疫苗)的猪和小鼠能诱导产生中和抗体，但是对于GⅠ型毒株的攻击不能提供完全保护[36]。通过在仓鼠肾细胞(BHK-21细胞)将GⅠ型强毒株连续传120代得到了弱毒株候选疫苗(SD12-F120)，接种免疫小鼠后可对GⅠ型强毒株提供完全保护[37]。此外，国际上也在积极研发GⅠ型毒株(KV1899)衍生疫苗，其灭活疫苗可在猪体内诱导很高水平的中和抗体，同时也在非洲猴肾细胞(Vero细胞)中进行弱毒活疫苗的开发[38]。因此，针对GⅢ型和GⅠ型毒株疫苗交叉保护作用较差的问题，可采用构建二价疫苗或者多价疫苗的疫苗研发策略来控制多种基因型流行造成的混合感染。此外，还要在疫苗佐剂、给药系统和免疫程序等方向开展更多研究，以便开发更好的乙型脑炎疫苗。

5 结 语

近二十年来，乙型脑炎病毒的优势基因型在我国乃至整个亚洲地区都出现了由GⅢ型向GⅠ型转变，根据国内外最新研究数据，可以推断原因很可能是病毒本身对水禽宿主的适应性差异。病毒优势基因型的转换和流行范围的扩大给乙型脑炎的防控工作带来了新的挑战，因此需要加快研发不同基因型的疫苗来应对乙型脑炎病毒造成的感染。

此外，乙型脑炎病毒的主要媒介昆虫是库蚊，因此根据气候变化和地理位置不同会出现全年持续流行和季节性流行，感染的候鸟以及蚊子共同的地理分布很大程度上决定着乙型脑炎病毒的传播流行地区[39-40]。在温带地区，受感染的蚊子也可以通过垂直传播的方式帮助病毒越冬。因此，根据蚊子的越冬习性加强越冬蚊子的治理也是控制病毒传播的有效途径[41-43]。近年来，由于全球气候逐渐变暖，蚊子的地理分布区域不断扩大，因此可能将出现更多新的乙型脑炎病毒疫区[44-45]。所以,可采取的预防措施还包括有效地控制蚊虫和避免被蚊虫叮咬。通过加强人类住所和动物畜舍的卫生措施隔绝蚊子入侵，特别是在黎明和黄昏等蚊子活动高峰期开展灭蚊措施，可以减少蚊子叮咬的机会，从而有效地降低乙型脑炎病毒感染的风险。