海洋降解麻痹性贝类毒素细菌的筛选及其耐毒能力初探

张庆芳 ，韩鹏飞 ，谢丹丹 ，迟雪梅 ，迟乃玉 ，刘春莹 *

（1.大连大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622；2.辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁 大连 116622）

海洋贝类具有肉质鲜美、营养丰富、绝大多数种均可食用的特点，是我国重要的水产养殖物种。据不完全统计，2019年我国海水贝类养殖面积达到120.4万hm2，占海水养殖总面积的60.4%, 养殖海水贝类产量高达1457.9万t，占总海水养殖量的70.6%[1]。随着工业的不断发展，大量的污染物质被投放到水体中，造成水中氮、磷等元素大量累计，导致一些产毒微藻大量繁殖，其所产毒素大量富集在迁移能力较差的贝类体表和体内，造成贝类死亡，人类食用后对健康产生巨大威胁[2-3]。最近，河北省秦皇岛市出现了食用贻贝中毒的系列事件，通过检测，发现有毒贻贝中麻痹性贝类毒素（Paralytic shellfish toxins，PSTs）含量超过了安全限量标准的2倍，目前仍没有有效的药物治疗贝类毒素引发的中毒[4-5]。

PSTs 是贝类毒素中含量较高、范围广、毒性较强的毒素[6-9]，主要由海洋鞭毛藻属产生，在牡蛎、 扇贝等滤食性双壳贝类的消化器官中积累[10-11]。PSTs的毒性作用是通过在哺乳动物神经细胞中钠通道的可逆阻断实现的，由于钠离子的流入对电位变化至关重要，阻断它可以阻止动作电位的形成，从而产生PSTs特有的神经症状[12-14]，引发人体的神经系统功能损伤[5,15]。PSTs 中毒事件常暴发于全球温带和亚热带沿海地区，已经引起了严重的公共卫生关注，具有明显的毒性表征，口服致死量约为1 mg，对旅游业、餐饮行业造成了重大的打击[16]。因此，加强对海产品贝类的毒素含量监测，不断探索可降解贝类毒素的方法，对于食用性贝类脱毒和养殖贝类脱毒具有重要意义。

目前PSTs 的清除方法可分为化学法、物理法和生物法。化学法目前是欧洲委员会批准的一种净化受污染产品的方法——氯水降解。但这种方法存在一定的问题，如氯残留或副产物较多等[17]。物理净化是通过加热、吸附等来降低PSTs 含量的方法，但贝类毒素热稳定性好，降解效率低[18]。生物法是利用微生物代谢或酶转化贝类中的PSTs[19,20]。微生物降解毒素法是目前人们普遍认同的对人体伤害少、更不会造成环境二次污染的一种方式[21-23]。C.J.Donovan 等[11]在紫贻贝中得到了能够降解PSTs 的菌株；E.A.Smith 等[24]在几种常见贝类中筛选得到了降解PSTs 的菌株。N-磺酰氨甲酰基类毒素是PSTs中占比较大的一类毒素，如何降解该类毒素是目前的研究热点[6-7,9,25]，但目前关于微生物降解N-磺酰氨甲酰基类毒素的报道很少，菌种资源匮乏，产业化更无法实现，其重要性也不言而喻。

本研究通过平板涂布筛选法，从大连渤海海域野生牡蛎消化腺中筛选得到4 株形态不同的菌株，并研究不同PSTs 毒素浓度对菌株生长能力的影响，旨在筛选出能够降解N-磺酰氨甲酰基类毒素的微生物，为接下来的食品和养殖中产业化降解贝类毒素研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品

大连渤海海域（121°790398′E，39°033197′N）采集的野生牡蛎的消化腺。

1.2 主要试剂和仪器

N-磺酰氨甲酰基类毒素标准品CRM-C1&2-b，National Research Council Canada 提供； 硝酸铵-15N2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；恒温摇床（型号为CRY-2112），上海茸研仪器有限公司产品；生物安全柜（型号为LA2-4A1），新加坡艺思高科技有限公司产品；恒温培养箱（型号为LTI-700），上海爱郎仪器有限公司产品；全自动生长曲线分析仪，OY Growth Curves AB Ltd.L（Finland）产品；培养基所需的其他化学试剂，天津市大茂化学试剂厂产品。

1.3 培养基配制

海洋菌肉汤液体培养基：蛋白胨5 g·L-1，酵母粉1 g·L-1，氯化钠19.45 g·L-1，无水氯化镁5.9 g· L-1，硫酸钠3.24 g·L-1，柠檬酸铁0.1 g·L-1，氯化钙1.8 g·L-1，氯化钾0.55 g·L-1，碳酸氢钠0.16 g·L-1，硼 酸0.022 g · L-1， 溴 化 钠0.08 g · L-1， 氯 化 锶0.034 g·L-1，氟化钠0.0024 g·L-1，硝酸铵0.0016 g·L-1，磷酸氢二钠0.08 g·L-1，pH值（7.6±0.2）。

海洋菌肉汤固体培养基：在海洋菌肉汤液体培养基的基础上加入1.5%的琼脂。

1.4 降解N-磺酰氨甲酰基类毒素菌株的初筛

将从大连渤海海域捞取的野生牡蛎的消化腺取出，称重，为6.18 g，充分研磨后用200 mL无菌蛋白胨水冲洗（无菌环境中进行），4 ℃、3000 r·min-1离心5 min，取上清液，得到牡蛎消化腺菌液。将得到的菌液以1%的接种量于10 mL 海洋肉汤液体培养基中培养48 h（30 ℃，160 r·min-1），当菌液OD600值 达 到0.4～0.6 时 进 行 梯 度 稀 释， 取10-5、10-6、 10-7稀 释 倍 数 的 菌 液， 分 别 与20 μL 的15.05 μmol · L-1、 150.50 μmol·L-1毒素标准品混合，涂布于海洋肉汤固体培养基上（对照组用不含有毒素的海洋肉汤固体培养基），30 ℃恒温培养72 h，挑取生长出的单菌落，进行形态学观察，将目的菌株进行分离纯化及保藏，用于进一步研究。

1.5 降解N-磺酰氨甲酰基类毒素菌株的复筛

将初筛得到的菌以2%的接种量分别加入到含有15.050 μmol·L-1、0.750 μmol·L-1、0.301 μmol·L-1N-磺酰氨甲酰基类毒素标准品的250 μL 海洋肉汤液体培养基中，以不加N-磺酰氨甲酰基类毒素的海洋肉汤液体培养基作为对照组，30 ℃、160 r·min-1进行培养，间隔2 h 取1 次样，用全自动生长曲线分析仪培养和检测培养液OD600值，每组3 个平行；绘制菌株的生长曲线，根据其生长情况初步判断菌株是否具有利用、降解N-磺酰氨甲酰基类毒素的能力。

1.6 菌株的鉴定

将能够利用毒素的菌株进行简单染色及革兰氏染色镜检，并观察其菌落特征，对菌株进行初步鉴定。

2 结果与分析

2.1 降解N-磺酰氨甲酰基类毒素菌种筛选

能够在含有N-磺酰氨甲酰基类毒素的海洋肉汤培养基中进行生长的菌株，可能具备降解该毒素或者耐受该毒性的特性。分别用含有15.05 μmol·L-1、150.50 μmol·L-1浓度N-磺酰氨甲酰基类毒素的初筛培养皿进行牡蛎消化腺菌液培养，结果显示，在含有毒素的初筛培养皿中，菌落数量减少；在含有高浓度毒素初筛培养皿上的菌落数明显少于低浓度培养皿菌落数（见图1a、b），说明毒素对于大多数微生物的生长具有抑制作用，而能够在高浓度毒素初筛培养皿上生长的微生物，对该毒素具有更高的耐受性或者降解能力。通过菌落及菌体形态观察（见表1），初步判断从牡蛎消化腺中筛选得到了疑似能够降解或耐N-磺酰氨甲酰基类毒素的4 株菌，命名为H-1号、H-2号、H-3号、H-4号；这4株菌的菌落形态均为表面光滑、湿润，菌体为杆状或球状，无芽孢，可以初步判断皆为细菌。并对比各菌株在无毒及有毒情况下菌体的形态变化（见表1），结果显示加了一定量毒素后菌株个体都比不加毒素小且形态均一。

表1 初筛得到的4株菌的形态学特征

图1 牡蛎消化腺菌液在含毒初筛培养基上的菌落生长情况

2.2 生长曲线测定

分别在加入了15.050 μmol·L-1、0.750 μmol·L-1、0.301 μmol·L-1N-磺酰氨甲酰基类毒素的海洋肉汤培养基中培养初筛得到的4 株菌，绘制其生长曲线，同时与未加毒素的对照组进行对比分析，结果见图2。

图2 初筛菌株在不同毒素浓度下的生长曲线

H-1菌株（见图2a）在较低浓度（0.750 μmol·L-1、0.301 μmol·L-1）毒素下，生长趋势和对照组（0 μmol·L-1）相似，基本不受影响；但在高浓度（15.050 μmol·L-1）毒素下，培养0～16 h 时基本不生长，处于延滞期，16 h 后才开始进入指数生长期，OD600值低于对照组，说明高浓度毒素对H-1 菌株的生长有抑制作用。

H-2 菌株（见图2b）在不同浓度毒素（15.050 μmol·L-1、0.750 μmol·L-1、0.301 μmol·L-1）下，其生长趋势与对照组（0 μmol·L-1） 基本相同，OD600值变化不大，说明不同浓度的毒素对菌株生长基本无影响，该菌株可能具有耐毒的作用。

H-3 菌株（见图2c）在培养0～16 h 时，较低浓度毒素（0.750 μmol·L-1、0.301 μmol·L-1） 下生长趋势和对照组（0 μmol·L-1）相似，高浓度毒素（15.050 μmol·L-1）下生长趋势相较于对照组生长缓慢，这说明在高浓度毒素下，菌株生长前期得到驯化；培养16～30 h时，添加不同浓度毒素的菌株的OD600值均高于对照组，且随着毒素浓度的增加而增加，这说明该菌株可能具备降解毒素的能力。

H-4 菌株（见图2d） 在3 个毒素浓度（15.050 μmol·L-1、0.750 μmol·L-1、0.301 μmol·L-1）下的生长趋势和对照组（0 μmol·L-1）相似，OD600值变化不大，说明不同浓度（15.050 μmol·L-1、0.750 μmol·L-1、0.301μmol·L-1）的毒素对菌株生长基本无影响，该菌株可能具备耐毒的作用。

综上判断，H-3 号菌株具有降解利用N-磺酰氨甲酰基类毒素的能力，H-2、H-4号菌株具有较好的耐N-磺酰氨甲酰基类毒素的能力。

2.3 染色结果

将筛选得到的菌株H-2、H-3、H-4 号进行革兰氏染色，染色结果见图3。图3显示，H-2、H-3号和H-4 号菌株均为革兰氏阳性菌，但H-4 号菌株着色较浅。

图3 菌株革兰氏染色结果

3 讨论与结论

本研究从渤海海域野生牡蛎消化腺中筛选得到了一株能够利用N-磺酰氨甲酰基类毒素的海洋细菌H-3，两株耐N-磺酰氨甲酰基类毒素的海洋细菌H-2和H-4。不同浓度毒素对上述菌株生长情况的影响结果显示，H3 菌株对低浓度毒素（0.750 mmol·L-1、0.301 mmol · L-1） 具有耐 受 力， 而高浓 度 毒素（15.050 mmol·L-1）在H3 菌株生长前期降低了其生长速度，但随着培养时间的增长，H3 菌株明显表现出能够利用毒素的能力；且随着毒素浓度的增加，其生长量逐渐升高，这可能意味着经过毒素的驯化，H-3号菌株对于毒素的降解利用率得到了提高，且有可能具备降解其他种贝类毒素的功能。结果为今后研究麻痹性贝类毒素的降解提供了菌种资源。H-2 和H-4 菌株主要表现出对N-磺酰氨甲酰基类毒素的耐受，其降解该毒素的能力还有待于进一步验证。此外，本研究通过将毒素和菌液混合后涂平板进行筛菌，这种方式操作简便、可行性强、节约成本，也为其他菌株的筛选提供一种简便、可行的方法。

鉴于目前贝毒通过海产品的食用而富集在人体内引发一系列疾病，甚至死亡，也造成海产品在养殖过程中贝毒含量超标而影响养殖业的收入，造成经济收益降低等情况，可对这种具有耐或降解麻痹性贝类毒素能力的菌株进行发酵条件、降解毒素机理、代谢机制、基因克隆表达等进一步研究，例如期望得到能够直接降解麻痹性贝类毒素的酶，用于快速检测麻痹性贝毒含量；或通过耐毒与不耐毒的菌株混合，制成检测麻痹性贝毒试剂，根据两种菌株生长量来判定贝类毒素的含量范围；也可开发成微生物制剂，通过降解藻类产生的毒素或者降解贝类消化腺内的毒素来降低对人类的危害，可广泛应用于海洋食品生产和养殖行业。