苗药验方四大血对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡和焦亡的影响

吴 宁，袁桃花，姬进忠，程 瑶，李明义，梁 玺，孙见飞，刘 华，吴昌学

贵州医科大学1基础医学院，2临床医学院，贵州 贵阳 550025；3贵州医科大学医学分子生物学重点实验室，贵州贵阳550004

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性、炎症性的自身免疫系统疾病［1］，在所有关节病中致残率高居首位，主要病理表现是滑膜血管翳及炎症［2-3］。成纤维细胞样滑膜细胞（FLSs）是构成滑膜结构的主要细胞，活化的RAFLSs表现出类似于肿瘤样特性，在关节炎症部位处于异常活化增殖状态［4］，而RA滑膜增生与FLSs凋亡缺失密切相关［5］，目前临床上无根治RA的药物［6-7］。由黑骨藤、见血飞、五花血藤及鸡血藤4味藤本药材组成的苗药验方“四大血”（SX）是苗药中通气散血的天然药方，也是治疗RA的经典药方，但仍处于经验用药阶段［8-10］。本课题组前期研究结果显示，SX对胶原诱导关节炎大鼠（CIA）有良好的疗效，能缓解关节肿胀程度、抑制关节滑膜组织增生等病理表现［8-10］。研究表明，RA-FLSs的过度增殖、凋亡不足及焦亡等在RA的破坏和持续炎症中发挥关键作用［5］，然而SX调控凋亡和焦亡相关因子表达、治疗RA的作用机制研究较少。因此，本研究通过数据挖掘并分析与RA相关的凋亡和焦亡蛋白，并对重要关键靶蛋白进行分子对接和体外实验，观察SX对RA-FLSs MH7A细胞增殖、迁移、侵袭的影响，探究其对凋亡和焦亡的作用机制，为SX临床开发及RA治疗提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞和药物 人源第2代RA-FLSs MH7A细胞购自中国BLUEFBIO，附ATCC公司提供的短串联重复序列鉴定；苗药SX由贵州中医药大学苗医药教研室提供、并经田振华副教授鉴定，雷公藤多苷片购自远大医药黄石飞云制药有限公司。

1.1.2 主要试剂和仪器 高糖培养基（GIBCO），胎牛血清（FBS）、0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）胰酶、磷酸缓冲盐溶液（PBS；美国BI），四唑盐［MTT］细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒、2,2'-二辛可宁酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒及二甲基亚砜（DMSO；北京索莱宝），基底胶（美国BD），Caspase-1 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody（中国Huabio），B淋巴细胞瘤-2基因（BCL2）PolyclonalAntibody（中国Proteintech），Rabbit-anti-LC3、B淋巴细胞瘤-2 相关X（Bax）Rabbit mAb（美国CST）；CO2 细胞培养箱（上海Heal Force），酶标仪（美国BioTek），高端分析型流式细胞仪（美国BD）。

1.2 方法

1.2.1 RA 疾病及凋亡和焦亡靶蛋白检索 以“Rheumatoid arthritis”为关键词，通过治疗目标数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）、药物银行数据库（https://www.drugbank.ca/）、疾病相关的基因与突变位点数据库（https://www.disgenet.org/）检索RA靶蛋白；分别以“Apoptosis”、“Pyroptosis”为关键词，限定物种为人，通过京都基因和基因组百科全书（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）检索，获得凋亡和焦亡相关靶蛋白，并去重；利用UniProtKB 数据库（https://www.uniprot.org/uniprot/）将靶蛋白标准化，获得UniProt号［11］。

1.2.2 RA 疾病-凋亡-焦亡靶蛋白PPI 分析 利用VENNY2.1 软件绘制韦恩（Venn）图，获得与RA疾病相关的凋亡和焦亡靶蛋白，将靶蛋白输入String Version 10.5 数据库（https://string-db.org/），限定物种为人，将蛋白关系评分设为0.4，并隐藏出现的游离靶蛋白，下载靶蛋白互作（PPI）关系图［11］，利用Cytoscape Version 3.6.1软件进行可视化处理，获得RA疾病-凋亡-焦亡靶蛋白PPI网络图，并利用Network Analyzer分析其自由度、介数等网络拓扑特征值筛选PPI网络核心靶蛋白，其中自由度越大，靶蛋白在网络中越重要［11-12］。

1.2.3 分子对接技术验证 为了验证SX与凋亡和焦亡的关联，将SX中鸡血藤的主要活性成分cajanin、见血飞的主要活性成分oxychelerythrine、五花血藤的主要活性成分（-）-Catechin gallate、黑骨藤的主要活性成分eleutheroside A 与凋亡和焦亡相关蛋白靶点进行分子对接验证。从PubChem（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）平台下载药物活性成分的3D结构，通过PyMOL2.4.0软件转换为PDB格式，从PDB（http://www.rcsb.org/）数据库下载候选靶蛋白的3D结构，然后用PyMOL2.4.0软件去除水分子和配体后制备蛋白受体。最后，通过AutoDock vina 软件进行分子对接，对接结果用自由结合能评价，自由结合能≤-5kJ/mol，表示化合物和靶之间有良好的结合相互作用，结合能越低，对接模块越稳定，药物与靶蛋白相互作用的可能性越大，选择最低自由能模型通过PyMOL2.4.0软件进行可视化分析［13］。

1.2.4 细胞复苏和培养 液氮罐中取冻存细胞，转入37 ℃水浴锅，摇晃、融化细胞，转细胞培养瓶，加含10%FBS和1%双抗DMEM完全培养液3 mL，置于37 ℃、5%CO2培养箱，次日换液；待细胞长至80%～90%密度时传代，即弃原培养基，PBS 2 mL 洗2～3 次，加含0.25% EDTA胰酶500 μL消化，DMEM完全培养液终止消化，转移离心管，1000 r/min离心5 min，弃上清，加培养基重悬细胞，按照1∶3比例接种于新培养基，每瓶含培养基3 mL，置培养箱中传代培养，每日观察细胞生长情况，取第3～4代生长良好、密度为80%～90%的细胞进行后续实验［14］。

1.2.5 MTT法测SX对MH7A细胞抑制情况 将细胞以8×103个/孔的密度接种于96孔板中，180 μL/孔，边缘孔加PBS，置于5% CO2、37 ℃培养箱，当细胞密度达到80%汇合时，加不同浓度的SX（5、10、20、40、60、80、100、200、300、600、900 mg/L），每组8个复孔，继续置于培养箱中培养24、48、72 h，吸弃上清，加DMEM完全培养液90 μL和MTT溶液10 μL，培养4 h；吸掉上清，每孔加蓝紫色结晶甲臜溶解液110 μL，置摇床上，80 r/min震荡10 min，使结晶物溶解，测量每孔细胞的吸光度值A450nm［15］。设置调零对照孔（培养基、MTT、DMSO）和实验孔（细胞、培养基、MTT、DMSO及药物）、空白组（细胞、培养基、MTT及DMSO），计算药物对MH7A细胞的抑制率［细胞抑制率=（A对照孔-A实验组）/（A对照组-A空白孔）×100%］，采用SPSS软件计算半数抑制率（IC50），并根据IC50值选取给药浓度。

1.2.6 细胞分组 细胞长至80%～90%密度时，按照随机数字表法分为空白对照组、阳性雷公藤多甘片（TGT）对照组（TGT组，5 mg/L TGT）及5、10、20、40 mg/L SX组。

1.2.7 药物的制备 SX水煎剂按照传统方法制备。单味苗药五花血藤、鸡血藤、见血飞及黑骨藤按照15∶22∶15∶8的比例配制，共取600 g，参考文献［8-10］煎制浓度为4 kg/L的试药（按生药量计），质量控制标准为每制150 mL SX水煮液原药材nangxdlobghat（仰嗟嘎）不低于80 g、hsobhxangt（梭向）不低于150 g、ghabjongxbelsobxok（嘎龚布梭学）不低于150 g 及vobmongbdlenb（莴蒙棱）不低于220 g；以上制备的中药水煎液，采用旋转蒸发仪制备成中药粉末，避光密封常温保存；相应浓度药液用DMEM培养基配制，称取SX和TGT 10 mg加少量DMSO溶解，PBS定容至10 mL，以0.22 μm孔径的滤器过滤除菌2遍，得终浓度为1 g/L的母液，不同浓度药液用DMEM培养基稀释（DMSO含量<0.0001%）。

1.2.8 Wound-healing检测细胞的迁移能力 将浓度为3×102/L的MH7A单细胞悬液，铺于6孔板，100 μL/孔，加DMEM 完全培养基2 mL，每组设3 个复孔，置于37 ℃、5%CO2恒温箱中培养，待细胞长至70%～80%融合，用200 μL移液枪枪头在6孔板底部划“十”字，PBS洗1～2次，加无血清培养基拍照记录为0 h划痕状态；加5、10、20、40 mg/L SX及5 mg/L TGT无血清含药培养基2 mL，设置空白对照组（加相同体积的DMEM无血清培养基），分别培养6、12、24 h拍照，放大100倍；实验独立重复3次［16］，计算划痕修复率［划痕修复率（%）=（划痕宽度0h-划痕宽度24h）/划痕宽度0h×100%］。

1.2.9 Transwell检测细胞侵袭能力 实验前在冰浴中用不含血清的DMEM培养基以1∶1稀释基质胶，20 μL/孔包被Transwell小室，置于37 ℃培养箱2 h使基质胶聚合形成凝胶状，MH7A细胞融合度达到80%～90%，无血清培养基饥饿处理细胞24 h，消化细胞；并用5、10、20、40 mg/L SX组及5 mg/L TGT无血清含药培养基重悬细胞并计数，按1×102/L接种于Tanswell的上室，100 μL/孔，并设空白组（不含药物）；Transwell下室加含15%FBS的DMEM培养基500 μL/孔，干预MH7A 24 h，棉签拭去Transwell小室未侵袭的细胞，PBS洗2～3遍，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色20 min，蒸馏水洗涤3次，晾干后在倒置显微镜下观察，随机6～8个视野进行拍照计数［17］。

1.2.10 ELISA 检测凋亡和焦亡相关细胞因子的表达药物作用24 h，收集各组细胞上清液，参照Elisa试剂盒说明书步骤分别检测TNF-α、IL-1β、IL-18的表达水平，实验重复3次［9］。

1.2.11 Western blotting检测凋亡和焦亡相关蛋白的表达 细胞前处理和给药同“1.2.5”，药物作用24 h，冰上收集蛋白样本，BCA试剂盒测蛋白浓度；蛋白变性后取20 g上样电泳，转膜（条件为200 mA和2 h），5%脱脂奶粉封闭过夜，孵育一抗，内参（β-Actin）、Bax、Bcl-2、Caspase-1、Fas、FasL抗体的稀释比和孵育时间分别1∶1 000 和室温2 h或4 ℃过夜，1×TBST洗膜5 min/次、洗6次，孵育二抗（1∶1 000、室温脱色摇床缓慢摇动2 h），洗膜（同前），曝光显影，凝胶成像仪上进行蛋白条带检测和灰度分析［18］。

1.3 统计学分析

用SPSS19.0软件对数据进行分析，结果用均数±标准差表示，各组间的数据比较采用单因素方差法分析，两两比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA相关蛋白的网络药理学分析

数据库检索出满足条件的RA疾病靶蛋白306个，凋亡靶蛋白136个，焦亡靶蛋白180个（图1）；其中与RA相关的凋亡靶蛋白9个，关键靶蛋白包括肿瘤坏死因子受体超家族成员6（Fas-6）、肿瘤坏死因子配体超家族成员6（FASLG-6）、诱导髓系白血病细胞分化蛋白Mcl-1（MCL1）、Bcl-2相关蛋白A1（Bcl-2A1）等；焦亡靶蛋白15个，关键靶蛋白包括肿瘤坏死因子（TNF）、转录因子AP-1（JUN）、组织蛋白酶B（CTSB）、信号传导和转录激活子1（STAT1）等；三者相互关联的靶蛋白4个，包括白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-1（CASP-1）、受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）等（图1、2，表1）。

表1 RA-凋亡-焦亡相关靶蛋白网络的拓扑参数Tab.1 Topological parameters of the RA-apoptosis-pyroptosis-related target protein network

图1 RA-凋亡-焦亡基因映射Venn 图Fig.1 Venn map of gene mapping of RA-apoptosispyroptosis.Blue represents the target proteins of rheumatoid arthritis,pink represents the target proteins of apoptosis,and green represents the target proteins of pyroptosis;the numbers represent the numbers of the target proteins.

2.2 分子对接技术验证

SX的主要活性成分与凋亡和焦亡相关蛋白的亲和力，结果显示SX中鸡血藤的主要活性成分cajanin、见血飞的主要活性成分oxychelerythrine、五花血藤的主要活性成分（-）-Catechin gallate、黑骨藤的主要活性成分eleutheroside A 与TNF-α、Fas、FasL、Bcl2、Bax、Caspase-1、IL-1β、IL-18均具有较好的亲和力，主要通过氢键和疏水作用力相互作用；结合能用于评价对接分子之间的结合强度，结合能≤-5.0 kJ/moL 即表明药效分子与蛋白对接效果良好，结合能越低，受体和配体的亲和力越高，化合物与目标位点的结合越稳定。对接结合能能量值见表2，从表中可知：cajanin、oxychelerythrine、（-）-Catechin gallate、eleutheroside A四个成分与TNF-α、Fas、FasL、Bcl2、Bax、Caspase-1、IL-1β、IL-18的结合能均≤-5 kj/moL，“四大血”治疗RA的机制可能与调控凋亡和焦亡相关蛋白有关，选取结合能较强的靶蛋白与小分子，利用PyMoL软件可视化处理，结合模式（图3），从图中可看到靶蛋白与分子的具体结合位点，oxychelerythrine可能通过氢键作用于TNF-α的TYR-151等氨基酸残基；eleutheroside A可能通过氢键作用于TNF-α的LYS-98、SER-95、ILE-97 等氨基酸残基；cajanin可能通过氢键作用于Bax的LYS-128等氨基酸残基，（-）-Catechin gallate可能通过氢键作用于Fas的GLY-46、ASN-67、SER-42等氨基酸残基，通过分析可知在配体与靶标蛋白结合中主要包含氢键作用力与疏水作用力，其中起主要作用的是氢键作用力，图中黄色虚线表示氢键相互作用力（表2、图3）。

图3 结合能较低的主要化合物与靶点最优结合模式Fig.3 Optimal binding mode of the main compounds with low binding energy to the target.A:TNF-α and oxychelerythrine docking mode.B:TNF-α and eleutheroside A docking mode;C:Bax and cajanin docking mode;D:Fas and (-)-Catechin gallate docking mode.

表2 SX主要活性成分与凋亡、焦亡相关蛋白对接结果Tab.2 Docking results between the main active components of SX and apoptosis-and pyroptosis-related proteins

图2 RA-凋亡-焦亡相关靶蛋白PPI分析Fig.2 Analysis of RA-apoptosis-pyroptosis-related target protein interaction.A:Target proteins related with RA and apoptosis.B:Target proteins related with RA-apoptosis-pyroptosis.C:Target proteins related with RA and pyroptosis.The circles represent the target proteins,and the lines represents the interaction between the target proteins.The darker the color and the larger the circle in the figure,the more important the target protein in the network.

2.3 细胞形态观察

倒置显微镜明场下观察培养瓶中的MH7A细胞呈漩涡状生长，表现为多样性形态如梭形、星形、树突状等；传至2～3代后，MH7A细胞密集生长，形态由多样性逐渐变为大小均一的梭形，折旋旋光性强，增殖快，对胰酶敏感，生物活性较为活跃；随着培养传代增多（一般为6～8代），细胞胞体的光亮度逐渐下降，胞质中出现颗粒物质，生长缓慢，胰酶消化时间增强。因此本实验选2～3代MH7A细胞用于实验，细胞活力较好（图4）。

图4 第3代MH7A细胞形态图Fig.4 Morphology of MH7A cells of F3 generation(Original magnification:×100).

2.4 细胞抑制率

细胞抑制率结果显示，与空白对照组比较，给药处理24 h时60、80、100、300、600、900 mg/L SX组MH7A细胞抑制率增加，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；与空白对照组比较，给药处理48、72 h 时，80、100、300、600、900 mg/L SX组MH7A细胞抑制率增加，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01，表3）。24、48、72 h对应的SX对MH7A细胞作用的IC50分别为88、42、83 mg/L；24 h 时，SX 浓度<60 mg/L 时对细胞无抑制作用，因此设置SX给药处理24 h的浓度为5、10、20及40 mg/L作为后续实验的浓度依据（表3）。

表3 各组MH7A细胞不同时间点的细胞抑制率Tab.3 Cell inhibition rate of MH7A cells at different time points of TGT or SX treatment(Mean±SD,%)

2.5 细胞迁移

药物作用0、6、12、24 h结果显示，同一时间点内，MH7A细胞的划痕修复率随SX浓度增加而减少，同时点内各浓度与空白对照组相比，不同浓度给药组及TGT组差异有统计学意义（P<0.05，图5）。

图5 各组MH7A细胞不同时间点的细胞迁移Fig.5 Cell migration results of MH7A cells treated for different lengths of time.A:Wound healing assay(×100).B:Quantitative analysis of the migrated cells.*P<0.05 vs blank control group at the same time;#P<0.05 vs TGT group at the same time.

2.6 细胞侵袭

实验结果显示，给药24 h，与空白对照组相比，20 mg/L、40 mg/L SX 组MH7A 细胞侵袭数目减少（13.37±0.33vs62.70±6.33，12.71±4.33vs62.70±6.33，P<0.05），5、10 mg/L SX组及TGT组MH7A细胞侵袭数目差异无统计学意义（46.70±5.33vs62.74±6.33，38.73±2.33vs62.72±6.33,51.33±0.33vs62.70±6.33，P>0.05，图6）。

图6 各组MH7A细胞的侵袭能力Fig.6 Invasive ability of MH7A cells in each group(Crystal violet staining,×100).A:blank control group.B:TGT group.C:5 mg/L SX group.D:10 mg/L SX group.E:20 mg/L SX group;F:40 mg/L SX group.

2.7 TNF-α、IL-1β、IL-18细胞因子的表达

与空白对照组比较，20 mg/L、40 mg/L SX 组和TGT组MH7A细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-18的表达水平均下降（P<0.05 或P<0.01），且20 mg/L SX 组MH7A细胞上清液IL-1β的表达水平也下降（P<0.05，表4、图7）。

图7 各组MH7A细胞TNF-α、IL-1β、IL-18细胞因子的表达Fig.7 Expression of TNF-α,IL-1β and IL-18 in MH7A cells in each group.*P<0.05,**P<0.01 vs blank group.

表4 各组MH7A细胞TNF-α、IL-1β、IL-18细胞因子的表达Tab.4 Expression of TNF-α,IL-1β and IL-18 in MH7A cells in each group(Mean±SD,n=10)

2.8 细胞凋亡和焦亡蛋白的表达

与空白对照组相比，5、10、40 mg/L SX组MH7A细胞中Bax蛋白表达量均增加（P<0.05），5、10 mg/L SX组MH7A细胞中Bcl-2蛋白表达量增加（P<0.05），20、40 mg/L SX 组及TGT 组Bcl-2 蛋白表达量降低（P<0.05），20、40 mg/L SX组Bax/Bcl-2比值增加（P<0.05）；与空白对照组相比，5、40 mg/L SX 组MH7A 细胞Caspase-1 蛋白表达量降低（P<0.05），10 mg/L SX 组Caspase-1蛋白表达量增加（P<0.05）；与空白对照组相比，20 mg/L、40 mg/L SX组MH7A细胞中Fas和FasL蛋白表达量均增加（P<0.05，图8）。

图8 各组MH7A细胞Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2、caspase-1、FasL、Fas蛋白的表达Fig.8 Expression of Bax(A,B),Bcl-2(A,C),Bax/Bcl-2(A,D),caspase-1(A,E),FasL(A,F),and Fas(A,G) proteins in MH7A cells in each group.*P<0.05 vs blank group.

3 讨论

RA是以慢性炎症、关节滑膜细胞增生及血管翳等形成为主要特征的自身免疫性疾病［1-2］，其病情迁延不愈，病变可以累及肺、心、肾等全身不同脏器，以关节受累最为突出［2-3］。RA以显著滑膜细胞增殖为特征，FLSs是RA滑膜细胞中最主要的一种，其在软骨和骨破坏的过程中可导致细胞因子、趋化因子及基质降解分子的过量产生，进而促进免疫细胞浸润和软骨降解［2］，在RA中异常活化的RA-FLSs表现出类似于肿瘤样特性，可经历“肿瘤样”增殖、侵袭及迁移，可迁移到未受影响的关节，附着在软骨和骨上，侵入细胞外基质，并抵抗凋亡［18］。因此RA-FLSs的增殖扩散有助于RA的形成。目前，临床上没有治疗RA的特效药物，常用非甾体类抗炎药等西药，其主要以改善病情及控制炎症反应为主，易引起肝肾等脏器功能损坏等副作用，不易长期服用［4-5］。而中药民族药在治疗RA方面表现出整体调节、多途径、多环节的作用机制，疗效持久，且毒副作用小，已成为治疗RA的潜在有效药物［7］。苗医验方SX由4种藤本药材黑骨藤、五花血藤、见血飞及鸡血藤组成，具有良好的抗炎、镇痛作用，是苗族地区治疗RA的经典药方，但目前仍处于经验用药阶段［8-10］。因此，深入研究特色民族药物在治疗RA方面的作用机制，对于开展民族药物的研发以及指导其临床运用具有重要意义。

我们前期实验结果显示SX能改善CIA大鼠滑膜关节肿胀及畸形，但具体作用机制不清。本研究通过数据库挖掘和分子对接初步确定SX与凋亡和焦亡的关联。细胞凋亡包括内在固有和外在途径：外在途径以Fas信号通路为代表，Fas被激活后与FADD结合，进一步使caspases-3等凋亡执行分子被活化，引起细胞凋亡；内在途径通过各种信号通路引起Bcl-2家族蛋白的变化，最终引起细胞凋亡［19］。在RA发病过程中Fas表达改变，可导致滑膜细胞的增殖和凋亡失衡，促进RA的发展［20］。Bax和Bcl-2是细胞凋亡的促凋亡因子和抑凋亡因子，RA-FLSs细胞内出现的Bax与Bcl-2表达水平失衡以及Fas蛋白表达水平下降等凋亡逃逸现象可进一步加重炎症和骨质破坏［21］。细胞坏死是凋亡以外的一种细胞死亡，其在RA的发展中密切相关，其主要调控方式之一是细胞焦亡［22,23］。细胞焦亡经典作用途径依赖Caspase-1的激活，Caspase-1的活化可促进IL-1β和IL-18的成熟，进而释放至细胞外，招募炎症细胞，扩大炎性反应［24］。研究表明，可通过阻断细胞焦亡中某个环节作为新的药物靶点控制RA病情［25］。在机体内，细胞凋亡与焦亡的分子机制不同，但存在一定联系，GSDMD是唯一诱导焦亡的caspase-1底物，在没有焦亡底物GSDMD的情况下，caspase-1激活caspase-3/7并诱导细胞凋亡，而在细胞凋亡过程中，caspase-3/7通过在与使蛋白质失活的炎症性caspase不同的位点切割GSDMD来特异性地阻断细胞焦亡［26］，说明凋亡激活后可以抑制焦亡发生。而RA-FLSs中细胞凋亡途径的激活及抑制焦亡相关因子的表达，可降低RA关节滑膜炎症及关节的损害，减缓RA病程发展［21,27］。

TNF-α既与凋亡有关，又与焦亡有关，是RA滑膜炎产生和持续的关键因子，在RA的局部滑膜炎症、血管翳的生成和组织损伤中都发挥着重要作用［28］。通常，TNF-α通过一系列过程后可诱发凋亡效应蛋白Caspase-3的激活，引起邻近细胞吞噬，完成凋亡过程［29］。然而在RA中，TNF-α持续激活RA成纤维样滑膜细胞，导致细胞微环境改变，最终反而使成纤维样滑膜细胞抗凋亡能力增强而持续存活［30-31］。另一方面，有研究结果显示，RA患者FLS中NLRP3炎症小体的预活化依赖于TNF-α，且在NLRP3炎症小体常用的体外激活剂Nigericin介异的NLRP3炎症小体活化中，TNF-α预活化的细胞Caspase-1 p20的表达呈TNF-a浓度依赖性增加，IL-1β的分泌水平也显著升高［32］,说明TNF-α也与焦亡密切相关。

本研究通过数据库挖掘获得RA相关凋亡蛋白9个，焦亡蛋白15个，三者相互关联蛋白4个，包括IL-6、IL-1β、CASP1等。分子对接结果显示SX主要活性成分与TNF-α、Fas、Bax等蛋白均有较好的亲和力；故选取凋亡关键蛋白Bax、Bcl-2、Fas、FasL和焦亡蛋白Caspase-1、焦亡细胞因子IL-1β和IL-18，及炎症因子TNF-α进行了体外实验验证。结果表明，SX能抑制MH7A细胞的增殖、迁移及侵袭，降低了TNF-α、IL-1β、IL18细胞因子的表达，上调Bax、Fas、FasL蛋白的表达量、降低Bcl-2及Caspase-1蛋白表达量，说明SX可以促进凋亡，抑制焦亡，减缓炎症反应。我们推测SX处理后，TNF-α的释放减少，一方面直接减缓MH7A细胞的炎症反应和间接减少MH7A细胞焦亡发生而减缓其炎症反应，另一方面导致MH7A细胞抗凋亡能力减弱，进一步促进凋亡，凋亡激活后，可以切割焦亡底物，阻断了MH7A细胞焦亡发生，而焦亡抑制后，炎症因子释放减少，炎症反应进一步得到减缓。此外，凋亡的发生可能还导致MH7A细胞迁移、侵袭等能力下降，进而阻断RA-FLSs的增殖扩散，减缓RA。

综上所述，SX可抑制RA-FLSs MH7A细胞增殖、迁移及侵袭，促进RA-FLSs MH7A细胞凋亡并抑制其焦亡，减轻炎症反应。其分子机制可能与降低TNF-α、IL-1β、IL18细胞因子的表达水平，促进Bax、Fas、FasL，抑制Bcl-2和Caspase-1蛋白表达有关。该结果为SX临床治疗RA提供新依据，但SX通过调控细胞凋亡及焦亡相关信号通路或蛋白的表达来治疗RA的具体分子机制还有待进一步研究。