糖尿病肾脏疾病中肾小球相关差异表达基因的生物信息学分析

谈冬锦，石敏，徐玉迪，张红，

(1.徐州医科大学淮安临床学院，江苏 淮安 223300； 2.南京医科大学附属淮安第一医院内分泌科，江苏 淮安 223300)

糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病常见的微血管并发症之一，30%～40%的1型糖尿病和2型糖尿病患者可发展为DKD，其中约一半的患者将进展为终末期肾脏病，已成为糖尿病患者死亡的主要原因，对社会发展和人类健康造成严重威胁[1]。目前在治疗DKD方面，虽然已经证实新近研发的钠葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体激动剂可以延缓肾脏疾病的进展及减少心血管事件的发生[2-3]，但并没有从根源上遏制DKD的产生，需要更深入地了解DKD潜在的遗传因素和分子机制，从而确定更好的诊断和治疗方法。随着基因转录组学研究技术的广泛应用，产生了大量的高通量基因分析结果，从而诞生了众多的公共数据库，为研究疾病生物学过程和潜在的发病机制提供了便利。本研究利用生物信息学技术分析DKD中肾小球相关的差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)，通过富集分析评估其生物学功能，并建立蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络和微RNA(microRNA，miRNA)-DEGs调控网络等寻找关键基因和miRNA，以期为DKD的诊断和治疗提供新方向。

1 资料与方法

1.1数据的获取 本研究数据来源于美国国家生物技术信息中心-GEO(Gene Expression Omnibus)数据库，以“diabetic kidney disease”和“diabetic nephropathy”为关键词，研究类型为“Expression profiling by array”，物种为“Homo sapiens”，经过仔细筛选共获得36个数据集，选择GSE30528和GSE1009两个与肾小球有关的DKD数据集进行下一步分析，试验平台分别为GPL571和GPL8300。其中，GSE30528含有来自DKD患者的9个肾小球组织样本和13个对照肾小球组织样本。GSE1009含有3个DKD和3个对照人肾小球组织样本。

1.2DEGs的识别 利用GEO2R在线工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/geo2r)对微阵列数据进行处理，分别筛选两个数据集的DEGs，在下载DEGs数据后，进一步筛选，标准为|logFC|>1且调整后的P<0.05，并通过在线工具绘制韦恩图(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)获得在两个数据集中重叠的DEGs。

1.3生物功能和信号通路富集分析 将重叠的DEGs导入Metascape在线工具(https://metascape.org/)进行基因本体论(Gene Ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encycopedia of Genes and Genomes，KEGG)信号通路富集分析，筛选条件P<0.01，并利用R语言装载GOplot包使结果可视化，分析重叠DEGs的生物功能和参与的信号通路。GO富集分析包括生物学过程、分子功能和细胞组分。KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库，深入分析基因产物在细胞中的代谢途径和功能，有助于将基因及表达信息作为一个整体的网络进行研究。

1.4PPI网络的建立 将重叠DEGs导入STRING数据库(https://string-db.org/)分析对应的蛋白质之间的相互作用，构建PPI网络图，界值设定为0.4，结果应用Cytoscape软件可视化，利用CytoHubba插件选择最大集团中心性算法计算得到前5个基因即为Hub基因，从而分析网络中的核心蛋白质。

1.5miRNA-DEGs网络的建立 将重叠DEGs导入NetworkAnalyst在线工具(https://www.networkanalyst.ca/)，建立miRNA-DEGs交互网络，数据库采用miRTarBase v8.0，获得的miRNA进一步筛选，标准为自由度>2，应用Cytoscape软件 (https://www.cytoscape.org/)使结果可视化，从而分析重叠DEGs上游miRNA的调控情况。

2 结 果

2.1重叠DEGs的筛选 通过GEO2R在线工具分析两个数据集并形成火山图(图1)，根据标准进一步筛选，在GSE30528中确定了632个DEGs，在GSE1009中确定了49个DEGs，两个数据集之间的交集包含26个DEGs(图2)，均在DKD中表达上调，包括二氢嘧啶酶样蛋白3、1号染色体开放阅读框21、信号素5A、磷脂酶Cε1、ST3β-半乳糖苷α-2,3唾液酸转移酶6、1型血小板反应蛋白7A域、巨噬细胞金属弹力酶、凝血因子Ⅱ凝血酶受体、N-乙酰葡糖胺转移酶Ⅴ、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、生长抑制特异性蛋白1、同种异体移植炎症因子1、微管结合蛋白、细胞内氯离子通道蛋白5、叉头框蛋白C1(forkhead box protein C1，FOXC1)、IQ模体的GTP酶活化蛋白2、磷脂酶A2受体1、同源框基因1、凝血因子Ⅲ、成纤维细胞生长因子1、酪氨酸激酶3、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)、蛋白酪氨酸磷酸酶受体(protein tyrosine phosphatase receptor，PTPR)O、GDP甘露糖-4，6-脱水酶、肌钙蛋白C1、PTPRD。

2.2GO和KEGG富集分析 采用Metascape在线工具进行GO和KEGG富集分析，并利用R语言装载GOplot包使结果可视化，其中GO富集分析结果见图3，展示了每个层面上P值最小的5个富集项目，在生物过程上，重叠DEGs主要富集在肾脏和泌尿系统的形成以及正向调节细胞迁移等方面；在细胞成分上，主要富集在板状伪足、细胞前缘、肌动蛋白细胞骨架等方面；在分子功能上，主要富集在磷酸酯水解酶活性、蛋白质同型二聚化活性、糖胺聚糖结合等方面。KEGG富集分析结果见图4，重叠DEGs主要参与7条信号通路，包括糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end product，AGE)-AGE受体(receptor for advanced glycation end product，RAGE)信号通路、Rap1信号通路、钙信号通路、细胞骨架调节信号通路、Ras信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信号通路和癌症相关信号通路。

2.3PPI网络图 重叠DEGs形成的PPI网络图见图5，包括1个主网络和2个次网络，整个网络图由17个节点和16条边形成，其中VEGFA位于核心位置，与8种蛋白有关，如FOXCO1、BMP2、成纤维细胞生长因子1等。将PPI网络图信息导入Cytoscape软件，应用MCC算法得到排名前5的Hub基因为VEGFA、信号素5A、1型血小板反应蛋白7A域、磷脂酶A2受体1、FOXC1。

DEGs：差异表达基因；CON：正常对照组；DKD：糖尿病肾脏疾病组；fold change：差异倍数；1a：GSE30528；1b：GSE1009；蓝色：下调的DEGs；红色：上调的DEGs；黑色：无差异的基因

图2 两个数据集重叠的差异表达基因

2.4构建miRNA-DEGs网络 通过NetworkAnalyst建立miRNA-DEGs网络见图6，共获得693个节点，901条边。其中具有最多交互miRNAs的前3个基因为VEGFA、FOXC1、酪氨酸激酶3，边线分别为126、106、99。经过进一步筛选后得到36个miRNAs，其中hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20a-5p属于miR-17家族，共同靶向最多的6个DEGs，分别为VEGFA、BMP2、FOXC1、凝血因子Ⅱ凝血酶受体、凝血因子Ⅲ、PTPRO，靶向5个DEGs的miRNAs分别为hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-106b-5和hsa-miR-355-5p。

DEGs：差异表达基因；GO：基因本体论；BP：生物过程；CC：细胞成分；MF：分子功能

DEGs：差异表达基因；KEGG：京都基因与基因组百科全书；rich factor：富集到的基因数与该条通路基因总数之比；count：富集到该通路的基因数

DEGs：差异表达基因；PPI：蛋白质-蛋白质相互作用

miRNA：微RNA；DEGs：差异表达基因；粉红色圆形的为重叠DEGs，黄色六边形的为miRNA，中央两个黄色六边形是靶向6个重叠DEGs的miRNA

3 讨 论

DKD是糖尿病常见的一种微血管并发症，肾脏代谢环境的改变以及血流动力学的异常引发炎症、氧化应激、细胞去分化、细胞内信号通路异常等病理生理学活动[4-5]，出现肾小球基膜增厚、足细胞损伤、系膜基质扩张、肾小管萎缩和间质纤维化等病理改变，进而损伤肾小球滤过膜、破坏肾小管功能，最终出现白蛋白尿和肾功能下降[6-8]。虽然钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体激动剂能够改善DKD，但仍无法根治。随着基因组学和生物信息技术的发展，遗传学研究表明DKD的发病与基因转录组学改变有关，这为从根本上解决DKD提供了方向[9]。

本研究通过从GEO数据库中下载DKD相关的肾小球基因芯片数据集，采用生物信息学技术识别出2个数据集重叠的26个DGEs，进行GO和KEGG富集分析，结果显示，DEGs主要与肾脏和泌尿系统的形成、板状伪足、细胞前缘、磷酸酯水解酶活性、蛋白质同型二聚化活性等功能和细胞成分有关，参与的信号通路包括AGE-RAGE信号通路、Rap1信号通路、PI3K-Akt信号通路等。其中，AGE-RAGE信号通路能够触发多种途径，增加炎症细胞因子的释放，产生活性氧类，并激活核因子κB等加重DKD的进展[5,10]。而Rap1信号通路可以通过转录因子CCAAT/增强子结合蛋白-β-过氧化物酶体增殖物激活受体γ协同刺激因子1α信号改善链脲菌素诱导的糖尿病大鼠线粒体功能障碍，从而减轻肾小管损伤[11]。PI3K-Akt信号通路介导的自噬机制在DKD中受到抑制，降低了机体对高糖引起血管内皮功能障碍和足细胞损伤的敏感性，从而进一步加重肾损伤[12]。这表明筛选出的DEGs可以通过炎症、氧化应激、线粒体功能障碍、自噬等途径影响DKD的进展，但需进一步探究。

为了分析重叠的DEGs上游miRNA，本研究建立了miRNA-DEGs网络分析，结果显示hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20a-5p共同靶向最多的6个DEGs，而这两个miRNAs同属于miR-17家族，由6个序列相似、结构相仿、种子区序列相同(AAAGUGCU)、物种间高度保守的成熟体miRNA组成。有研究表明，DKD患者肾组织miR-17-5p和miR-20a-5p表达水平升高，体外实验中在高糖培养的小鼠足细胞中下调 miR-17-5p和miR-20a-5p能够有效抑制足细胞功能障碍、凋亡和纤维化[13-14]。Tian等[15]的研究表明，miR-20a-5p与circ-ADAM9上调的人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因和自噬相关蛋白7相互作用，从而抑制Akt和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的磷酸化，加剧高糖条件下内皮祖细胞的自噬和凋亡，引起血管内皮细胞功能障碍。在C57BL6J小鼠的糖尿病视网膜病变中，miR-20a-5p等8种miRNAs被检测到表达异常，而VEGFA、脑源性神经营养因子、过氧化物酶体增殖物激活受体α等被验证为失调miRNA的靶标，继而调节糖尿病视网膜的蛋白异常表达[16]。

在本研究PPI网络和CytoHubba插件计算得到的Hub基因中，VEGFA占据网络核心位置。VEGFA是足细胞高表达的血小板源性生长因子超家族的一种分泌型糖蛋白，其基因产物为同型二聚体，具有8个保守的半胱氨酸残基，与肾小球内皮细胞迁移、分化和存活密切相关[17-19]。肾小球内皮细胞利用蛋白多糖、糖胺聚糖、糖蛋白和可溶性血浆蛋白组成的内皮糖萼可以限制蛋白质通过高度特异化的肾小球毛细血管壁，而VEGFA为肾小球内皮细胞提供必要的支持功能，如再生、维持“开窗”信号和调节蛋白通道信号等，因此VEGFA水平过度升高被认为是DKD白蛋白尿产生的原因之一[20-22]，而阻断其受体血管内皮生长因子受体2可改善2型糖尿病DKD实验模型的肾损害[23]。网络药理学研究表明，治疗肾脏病的中药制剂雷公藤和黄芪可能通过下调VEGFA，减轻肾脏炎症，降低尿白蛋白水平[24-25]。因此推测DKD中miR-17家族过表达可引起足细胞损伤导致VEGFA分泌过度减少，肾小球内皮细胞功能异常，“开窗”信号不能维持，致使尿白蛋白水平升高不明显，这可能是部分DKD患者肾小球滤过率已出现降低而尿白蛋白排泄未相应增加的原因。

综上所述，本研究通过生物信息学技术获得DEGs，分析其生物学功能和富集的信号通路，并借助在线工具寻找到核心基因VEGFA，与Geng等[26]的结果类似，在此基础上进一步建立了miRNA-DEGs网络，探讨核心基因及其上游miRNA在DKD中所起的作用，为研究DKD的发病机制、诊断和治疗提供了新见解。然而，本研究样本量少且缺乏基础实验，下一步将进行动物实验和细胞实验加以验证，以进一步阐明miR-17家族与VEGFA在DKD中的联系和作用机制。