天山棱子芹的DNA条形码分子鉴定①

朱金芳，张 平，胡江兰，阿吉艾克拜尔·艾萨

（1中国科学院新疆理化技术研究所新疆特有药用资源利用重点实验室，乌鲁木齐 830011；2新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052）

天山棱子芹[Pleurospermum lindleyanum(Lipsky)B.Fedtsch.]又名矮膜苞芹（Hymenolaena nanaRupr.），俗名库鲁木提，为伞形科（Umbelliferae）棱子芹属（Pleurospermum）高山膜苞芹亚属（HymenolaenaDC）多年生草本植物[1]，是分布在我国新疆西南部海拔4 000 m以上山坡草地的珍稀药用植物[2]，是该地区具有较好药用价值的民族药材，当地居民一直有使用天山棱子芹防治糖尿病、高血压、冠心病、脑血栓等疾病的习俗[3-4]。

由于中药材质量受生长环境、气候条件、历史沿革等多种因素的影响，使其性状及质量存在较大的差异，甚至出现同名异物或同物异名的情况[5-6]。而仅通过植物形态学及传统的检测方法进行中药材的分类及质量控制已经不能满足我国中药现代化的要求。棱子芹属由植物学家Hoffmann于1814年建立以来，其范畴和亚属的区分主要依据植物形态学差异[7]。但由于形态学分类的局限性，导致棱子芹属的分类与鉴定比较困难。DNA条形码技术可以从基因水平弥补传统分类的不足，其分析的是生物的基因型而非表现型，鉴定结果不受环境、样品形态和材料来源的影响，可更加准确可靠地鉴定中药材[8-9]。目前，尚未见天山棱子芹DNA条形码鉴别方面的研究报道。

DNA条形码技术对药用植物的鉴定，通常选用核糖体DNA内部转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）、核糖体DNA第二内部转录间隔区（internal transcribed spacer 2,ITS2）和叶绿体基因psbA-trnH间隔区片段（psbA-trnH spacer sequences,psbA-trnH）进行扩增。ITS2适用范围较广，在动植物及真菌中均有应用。由于ITS2对植物DNA序列的扩增效率较为突出，因此常作为药用植物鉴定的主体序列[10-11]。psbA-trnH位于叶绿体基因，可作为药用植物辅助序列，避免鉴定结果受真菌影响[11]。本实验以ITS2和psbA-trnH为引物进行扩增，得到相应DNA片段，考证天山棱子芹的基原，以期为天山棱子芹将来的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂BIO-RAD电泳仪（美国伯乐公司）；BIO-RAD T100型PCR仪（美国伯乐公司）；Gel Doc XR凝胶成像仪（美国伯乐公司）；涡旋混合仪（无锡杰瑞安仪器设备有限公司）；天山棱子芹样本及种子（2019年9月采自新疆塔什库尔干塔吉克自治县）经新疆医科大学中医学院盛萍教授鉴定为伞形科植物天山棱子芹[Pleurospermum lindleyanum(Lipsky)B.Fedtsch.]及种子；DP320新型植物基因组提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司)；KT201 2×Taq PCR Master Mix(天根生化科技北京有限公司)；ITS2及psbA-trnH引物[生工生物工程（上海）股份有限公司合成]；GelRed染色剂[生工生物工程（上海）股份有限公司]；TBE缓冲溶液[生工生物工程（上海）股份有限公司]；琼脂糖（西班牙BIOWEST）。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取 取植物种子50 mg，加入液氮充分碾磨，参照新型植物基因组提取试剂盒（DP320）提取样品总DNA。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量及其完整性。将剩余DNA样品密封置-20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增及测序 本实验引物参考文献[12-13]使用ITS2及psbA-trnH序列的引物进行扩增，由Taq PCR Master Mix 25 μL，Sterilized dd H2O 19 μL，DNA模板2 μL、正反向引物各2 μL组成总体积为50 μL的PCR扩增反应体系。各引物对及其PCR反应条件详见表1。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并将扩增产物送至上海生工生物技术公司进行双向测序。

表1 PCR扩增引物及反应程序

1.3 数据处理测序结果使用Codon Code Aligner V6.0.2软件校对拼接，并将两引物测得的序列导入美国国立生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）进行比对。使用 MEGA-X软件对天山棱子芹及下载序列进行NJ树聚类分析。

2 结果

2.1 总DNA检测结果总DNA主条带（＞15 000 bp）清晰，表明已成功提取出天山棱子芹植物总DNA。见图1。

图1 样品总DNA电泳图

2.2 PCR扩增ITS2引物扩增产物主条带（500 bp）清晰，表明已成功扩增出目的产物，见图2A。psbA-trnH引物扩增产物主条带（500 bp）清晰，表明已成功扩增出目的产物，见图2B。

图2 PCR扩增样品电泳图

2.3 测序结果引物ITS2测序成功，共有403 bp，GC%：56.58%，扩增产物测定序列为：ATTTTCAAGCTGGGCTATTCCCGGTTCGCTCGCCGT TACTAGGGGAATCCTTGTAAGTTTCTTTTCCTCCGC TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGGTAGTCCCGCC TGACCTGGGGTCACAGTCGAGCGCGCACACTTTGT GGCACCGAAGGGTCCTCGAGCTAGCTTTGGTGACG GGTATTCGCGCAACATGAAAAGAGGGTCTTTTTAC AACCACAAATGTCACGACGTCCGTCGCCACAGGCT CACTTTTGGGCCAGCCACGCCGCAAGGCACGGGAG GCCAGTATCCGCCCCCGAACCAACGCATCTCCACA AGGAGAGTGTGGTTAAGGGCAACACGATGCGTGAC ACCCAGGCAGACGTGCCCTCAGCCTAGAGGACTTCGGGCGCAACTTGCGT引物psbA-trnH测序成功，共有499 bp，GC%：28.66%，扩增产物测定序列为：GTTATATCTTATATTGGCTAATCCGCCCCCCTAGTTT TTTTATTTGAATTTCAAAGGATTCCTTTTTGATCAAA TTGATCATACAATATTTATCTAAAAAGAGTCTTAAA ATAAAAATAAGTAAAAAATTACAACATTTTTTTTTT AAGAAATCCTTCCCAAAATAAAAATATTGGAAAAT ATTGGGAAGAAGGCAGCCAAGTTGTATAGAATGCA AGTATGATATTCAATCACGAACGAGCCCATAAAAA GAAAAATACGTTTGTCAAAATTTTTTTAAACAAACT AGGTAAATACTACTAAAAAAAAATAAAAAAAAAA GGAGCAAAACCGCCCCCTTGAAAAAACAAAAAAA AGGTTATTGCCCCTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTCAA AAAACCCGAAAAAAAAAAAACCCGGCTTTACCCTT TTGAAAAGGGGGCTTCACCACCCCCTAAATCTAAG GGGAAGTTTTGAGCTTTACTTTCTCAAAAAAAAA。

2.4 鉴定ITS2序列鉴定结果见表2，由引物ITS2所得DNA片段与数据库比对，最接近的物种为双子叶植物伞形科棱子芹属天山棱子芹（Hymenidium nanum），其相似性为98.2%。psbA-trnH序列鉴定结果见表3，引物psbA-trnH所得DNA片段与数据库比对，最接近的物种为双子叶植物伞形科瘤果芹属裂苞瘤果 芹（Trachydium involucellatum），其相似性为93.92%，小于天山棱子芹的相似性。因ITS2序列鉴定结果未受真菌影响，且相似度较高，故以此序列鉴定结果为主并对其进行聚类分析。

表2 天山棱子芹ITS2序列NCBI鉴定

表3 天山棱子芹psbA-trnH序列NCBI鉴定结果

2.5 NJ树聚类分析天山棱子芹样本（S）与天山棱子芹（Hymenidium nanum）聚为一支，支持率为92%，可推测样品的基原为天山棱子芹。另外，美丽棱子芹（Hymenidium amabile）与天山棱子芹、天山棱子芹样本（S）聚为一大支，支持率为85%，表明天山棱子芹与美丽棱子芹的亲缘关系较近。剩余各支的支持率均大于50%，表明ITS2序列可用于区分天山棱子芹与其它同属植物。见图3。

图3 基于ITS2序列构建的系统发育树

2.6 植物形态特征图4A、4B所示，天山棱子芹多年生草本植物，整株长5～30 cm，主根粗壮，质坚硬，直径0.3～1 cm，表面附有鳞片，棕褐色或灰棕色，底部有细横皱纹，基部有褐色或灰褐色残存的叶鞘。茎弯曲不分枝，圆柱形，长0.8～10 cm，直径0.1～0.5 cm，有条棱，带紫红色，中空，易折断。片轮廓长椭圆形，黄绿色至红棕色，皱缩卷曲，质脆易脱落。顶生复伞形花序腋生，直径3～5 cm。花果期8个月，果圆形或椭圆形，有明显隆起的纵棱，果梗长0.2～0.8 cm。气微香，味微苦。对比《中国植物志》中对其形态学特征的描述，见图4C所示，二者形态特征一致。可进一步确认样本的基原为天山棱子芹。

图4 植物形态特征图

3 结论

棱子芹属建立初期物种较少，随着更多学者的研究陆续将膜苞芹属、滇蒿本属、滇芎属等属的植物归入该属，使该属不断被扩大[7,14]。由于以上演化过程，使棱子芹属植物存在同物异名现象。《中国植物志》中收录天山棱子芹正名为[Pleurospermum lindleyanum(Lipsky)B.Fedtsch.]，异名为矮膜苞芹（Hymenolaena nana）,Pleurospermum nanum[2]，《中国生物物种名录》中收录天山棱子芹正名为[Pleurospermum lindleyanum(Lipsky)B.Fedtsch.]，异名为Hymenolaena lindleyana,Hymenolaena nana,Hymenidium nanum[15]。本文以ITS2序列为主，以psbA-trnH序列为参考，对采集的样本进行基原鉴定，以ITS2扩增序列与NCBI数据库比对，得到该样本与Hymenidium nanum（天山棱子芹异名）的相似度最高为98.2%。由此可以判断，与样本相似度最高的植物为天山棱子芹。再通过NJ树聚类分析，验证样本与天山棱子芹及其相似度较高的其他植物之间的分类并计算其可信度，结果表明样本与天山棱子芹聚为一支，再次证明ITS2序列对样品的鉴定结果可信度较高。最后，以《中国植物志》中天山棱子芹的形态特征为参考，比对样本的形态特征，发现样本与天山棱子芹形态特征吻合。综合传统的形态学与现代DNA条形码鉴定结果，最终确定样本的基原为天山棱子芹。