七氟烷吸入麻醉后调节保护脑梗死大鼠神经功能的机制研究

石春来

河南新乡公立医院麻醉科453002

0 引言

脑梗死即缺血性脑卒中，是由遗传因素等多种环境因素相互作用而引起的一种多因素疾病，是目前最为常见的致残原因[1]。炎症与氧化应激反应是脑梗死的主要生理学特征，在脑梗死的形成中发挥着重要作用[2]。Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）/核因子-κB(nuclear factor Kappa B，NF-κB)信号通路是调控炎症反应的重要通路之一[3]。有文献报道在脑缺血动物模型中TLR4/NF-κB信号通路被激活，并参与脑损伤[4]。基于此，笔者推测抑制TLR4/NF-κB信号通道可降低机体炎症反应，从而减轻脑梗死对脑组织的损伤。七氟烷后处理具有抑制细胞凋亡、保护神经的作用，但其作用机制尚未被阐明[5-6]。因此本研究拟通过七氟烷后处理脑梗死大鼠模型，探讨七氟烷后处理对脑梗死大鼠神经功能的保护作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

七氟烷（日本丸石制药株式会社），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde,MDA）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）试剂盒以及白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），兔抗大鼠TLR4、NF-κBp65、β-肌动蛋白抗体和羊抗大鼠IgG抗体（英国Abcam公司）。健康无特定病原体级雄性SD大鼠60只，6～7周龄，体质量范围220～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号为SCX K（京）2012-0001。本研究所有的动物实验均获得河南新乡公立医院实验动物福利伦理委员会批准。

Vamos麻醉气体监护仪（德国Draeger Medical公司），5430R低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 脑梗死大鼠模型的制备

所有大鼠术前禁食12 h，腹腔注射质量浓度为20 g/L的戊巴比妥钠麻醉，参照文献[7]采用Longa线栓法建立脑梗死大鼠模型，术后以Zea Longa5级评分法进行评估，1～3分为造模成功。

1.2.2 动物分组与处理

60只大鼠适应性饲养1周后按随机数字表法随机分为假手术组、脑梗死组和七氟烷后处理组（Sevo）组，每组20只。脑梗阻和Sevo组均用线栓法建立永久性局灶脑缺血大鼠模型，假手术组不予线栓。术后3组大鼠均放入处理箱内，Sevo组大鼠处理箱进气口通入七氟烷挥发的活性成分（七氟醚）和氧气，处理箱出气口连接麻醉气体监护仪，对处理箱内各气体体积分数进行持续性检测，维持处理箱内七氟醚的体积分数恒处于25%以及1 L/min的氧流量，使大鼠持续吸入30 min；假手术组和脑梗死组大鼠处理箱进气口通入氧气，氧流量同Sevo组，大鼠持续吸入30 min。

1.2.3 大鼠神经功能评估

经七氟烷或氧处理后将大鼠放回鼠笼，自由饮食。24 h后采用改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score，mNSS）[8]对大鼠神经功能进行评估，主要包括大鼠的感觉、运动、反射活动以及平衡木4个方面，总分为0～18分，分数越高表明神经功能损伤越严重。

1.2.4 大鼠脑梗死体积比测定

mNSS评估完毕后，每组随机取10只大鼠，取2 ml动脉血，离心取血清备用。取血后，迅速处死小鼠，取脑组织浸泡于质量浓度为9 g/L的NaCl溶液中10 min。沿冠状面均匀切成2 mm厚的切片，将切片浸泡于含质量浓度为20 g/L 2，3，5-三苯基氯化四氮唑的磷酸盐缓冲液中，37℃孵育30 min，再用质量分数为4%的甲醛溶液固定24 h。拍照并进行图像分析，图像中粉色为正常组织，白色为梗死脑组织，按下式计算脑梗死体积比。

1.2.5 大鼠脑组织神经元凋亡情况

法兰盘作为主要承力部分，主要承受密闭容器的内压力、清洗盘的压力、雷达测距装置拉力、LED发光标尺拉力、摄像头和照明系统的压力.采用ANSYS有限元分析软件对其进行静力学应力分析，然后通过优化可计算出法兰盘板厚.

mNSS评估完毕后，将每组剩余的10只大鼠处死取脑组织。沿冠状面切海马组织为两部分，一部分保存于-80℃冰箱中备用；另一部分依次进行多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片（3μm厚）和TUNEL染色，TUNEL染色具体操作按TUNEL试剂盒说明书进行。随机选取3张切片，每张切片随机选取5个视野，棕黄色细胞为阳性，计算阳性细胞数和神经元凋亡率。

神经元凋亡率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%

1.2.6 大鼠血清炎症因子水平检测

采用对应的酶联免疫吸附测定试剂盒检测大鼠的血清IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.7 大鼠氧化应激反应指标检测

取1.2.5节保存的大鼠脑组织制成匀浆，采用硫代巴比妥酸法测定脑组织中的MDA水平，黄嘌呤氧化酶法测定脑组织中的SOD活性，二硫代二硝基甲苯胺法测定脑组织中的GSH-Px活性。具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.8 大鼠脑组织中TLR4和NF-κBp65蛋白表达水平

1.3 统计学方法

采用SPSS21.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用F检验，两两比较采用q检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠mNSS评分、脑梗死体积比及脑组织神经元凋亡率比较

由表1可知，3组大鼠的mNSS评分、脑梗死体积比和脑组织神经元凋亡率比较，差异均具有统计学意义（均P＜0.001）；Sevo组的mNSS评分、脑梗死体积比和脑组织神经元凋亡率均高于假手术组并低于脑梗死组，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 3组大鼠mNSS评分、脑梗死体积比及脑组织神经元凋亡率比较（Mean±SD）

2.2 3组大鼠血清炎症因子水平比较

由表2可知，3组大鼠的血清IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α比较，差异均具有统计学意义（均P＜0.001）；Sevo组的血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平均高于假手术组并低于脑梗死组（均P＜0.05），而IL-10水平高于脑梗死组并低于假手术组（均P＜0.05）。

表2 3组大鼠血清炎症因子水平比较（Mean±SD）

2.3 3组大鼠脑组织中MDA水平及SOD、GSH-Px活性比较

由表3可知，3组大鼠脑组织中MDA水平及SOD、GSH-Px活性比较，差异均具有统计学意义（均P＜0.001）；Sevo组脑组织中MDA水平高于假手术组并低于脑梗死组（均P＜0.05），SOD、GSH-Px活性均低于假手术组并高于脑梗死组（均P＜0.05）。

表3 3组大鼠脑组织中MDA水平及SOD、GSH-Px活性比较（Mean±SD）

2.4 3组大鼠脑组织中TLR4和NF-κBp65蛋白表达水平比较

由表4可知，3组大鼠脑组织中TLR4和NF-κB p65蛋白表达水平比较，差异均具有统计学意义（均P＜0.001）；Sevo组脑组织中TLR4和NF-κB p65蛋白表达水平均高于假手术组并低于脑梗死组，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

表4 3组大鼠脑组织中TLR4和NF-κBp65蛋白表达水平比较（Mean±SD）

3 讨论与结论

人脑组织中存在许多神经细胞，其代谢过程较为旺盛，若出现缺血、缺氧的情况，反应极为敏感。由此，若脑部出现供血不足，则会产生大量氧自由基，引起氧化应激反应，产生炎症介质，导致脑组织细胞以及神经损伤[9]。脑梗死是临床上常见的脑血管疾病，可使脑血管变得狭窄或闭塞，导致供血区域病变如缺血、缺氧性病变[10]。有研究结果显示，通过减少大脑中的炎症和氧化应激反应以及脑细胞凋亡可有效改善脑梗死[11]。

七氟烷是一种较为新型的吸入麻醉剂，针对心血管疾病患者，七氟烷可提供血流动力学稳定性的麻醉。正常大鼠脑缺血时予以七氟烷处理，具有一定的神经保护作用[12]。本研究中七氟烷后处理对脑梗死大鼠的脑神经功能具有明显的保护作用，同时可有效改善脑梗死状况，降低脑组织神经元凋亡率，这与文献[13]的结果一致。

SOD是人体内天然的抗氧化酶，具有清除、降解体内自由基的作用，其通过清除体内过多的有害自由基，防止细胞被体内活性氧自由基损伤，从而起到保护脑细胞的作用[14]。GSH-Px同为人体内重要的抗氧化酶，在体内脂质过氧化和自由基清除中起着重要作用，基于此，具有缓解组织细胞膜结构和功能被损伤的作用[15]。脑组织中SOD和GSH-Px的活性水平直接反映了大脑的抗氧化应激能力。而MDA是人体氧化应激反应的代谢产物之一，通过测定脑组织中的MDA水平，可有效反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映细胞损伤程度[16]。在SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性降低，组织氧化与抗氧化失衡情况下，可引起脑组织细胞损伤、凋亡或坏死等[17]。本研究结果显示，经七氟烷后处理的脑梗死大鼠，其SOD和GSH-Px活性水平明显高于未经七氟烷后处理的脑梗死大鼠，且前者的MDA水平低于后者。因此，七氟烷可能通过降低脑梗死情况下机体的氧化应激反应，减少脑细胞凋亡以起到对脑神经的保护作用。

IL-6、IL-1β和TNF-α是反映人体内炎症反应的重要指标，这3项指标水平上升，可激活人体内中性粒细胞，增加炎症对脑组织的浸润程度[18]。TNF-α是全身炎症反应的使动介质，可促进IL-6、IL-1β的表达，进而促进炎症损伤反应[19]。IL-10作为强力抗炎症因子，可抑制多种炎症因子的释放，在脑缺血过程中具有保护神经作用，通过多种机制抑制脑缺血后炎症反应[20]。本研究中Sevo组IL-6、IL-1β与TNF-α水平均高于假手术组并低于脑梗死组，而IL-10水平高于脑梗死组并低于假手术组，可见七氟烷对脑梗后炎症反应具有抑制作用，可通过抑制炎症反应，减少炎症损伤，以起到对脑细胞和神经的保护作用。

TLR4/NF-κB信号通路在人体炎症反应的进程中发挥着重要作用，其中TLR4和NF-κBp65是该通路的关键信号分子，且TLR4对氧自由基、氧化物分子以及羟自由基等多种氧化应激反应产物具有识别作用[21]。有研究人员发现，体内应激反应水平升高时，TLR4/NF-κB信号通路被激活，最终导致炎症反应的发生；而TLR4/NF-κB信号通路激活的同时可激活IL-6、IL-1β与TNF-α等炎症因子的产生，从而加剧炎症反应的发生[22]。由此可推测TLR4/NF-κB信号通路在脑梗死中发挥着重要作用。本研究中脑梗死组大鼠的TLR4和NF-κBp65蛋白表达水平均明显升高，经七氟烷处理后脑梗死大鼠的TLR4和NF-κB p65蛋白表达水平均明显降低，提示七氟烷可降低TLR4和NF-κB p65蛋白的表达，继而抑制TLR4/NF-κB信号通路，降低炎症反应，起到对脑组织细胞和神经的保护作用，这与文献[23]的结果一致。

综上所述，七氟烷后处理可保护脑梗死大鼠的神经功能，其机制可能为抑制TLR4/NF-κB信号通路介导的炎症反应而减少炎症因子的释放，降低氧化应激反应和炎症，抑制细胞凋亡从而起到保护作用。然而，有文献报道七氟烷后处理可能通过PI3K/Akt/GSK-3β和PI3K/Akt/eNOS途径发挥神经保护作用[24]。因此，七氟烷后处理保护脑梗死大鼠神经功能的作用机制还可能与其他信号通路有关，还需进一步深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突