电感耦合等离子体质谱法测定氯化铵棕色口服溶液中19种元素的含量

张 敏，姜 玮，魏明刚，刘江云，姚 鑫，闫兆威*

(1.苏州大学附属第一医院药学部，江苏苏州 215006；2.苏州大学药学院，江苏苏州 215123；3.泰州市食品药品检验所，江苏泰州 225300；4.苏州大学附属第一医院中医科，江苏苏州 215006)

氯化铵棕色口服溶液是以复方甘草口服溶液和氯化铵为主要原料配制而成的复方制剂，临床上主要用于治疗急、慢性支气管炎及其他原因引起的咳嗽症状。中药制剂中含有多种无机元素，其中一些无机元素是人体必需的，是保证人体生长、身体代谢、生理机能调控的重要物质基础[1]。此外，还有一些元素为有害元素，如铅(Pb)、砷(As)、铜(Cu)等元素如果超标，将直接影响患者健康，对身体部分机能造成损害[2]。现行《中华人民共和国药典》中收载的口服液品种项下鲜有对重金属及其有害元素的限量做出规定。药品中元素杂质有多个来源，可能存在于原料药、辅料，也可能是天然存在的，或是人为引入等。由于元素杂质通常没有治疗作用，其在药品中的含量应该被控制在可接受限度内，每日的摄入量要低于每日允许暴露量。因此，探索中药口服液重金属及其有害元素的检测方法，并依据其测定结果进行风险评估，对保证中药制剂安全用药和药品质量具有十分重要的意义。

本研究拟参考《中华人民共和国药典》2020年版中的相关要求，建立电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定氯化铵棕色口服溶液中锂(Li)、硼(B)、铝(Al)、硅(Si)、钾(K)、钙(Ca)、钒(V)、铬(Cr)、铁(Fe)、钴(Co)、镍(Ni)、铜(Cu)、砷(As)、硒(Se)、钼(Mo)、钯(Pd)、锑(Sb)、钡(Ba)、铅(Pb)19种元素的分析检测方法，实现了多种元素的同时测定。并进一步通过主成分分析(principle component analysis,PCA)和偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)，找出差异显著的无机元素及其变化规律，最终为氯化铵棕色口服溶液重金属以及安全用药和质量控制提供理论基础，也为其他品种中药制剂口服液中重金属以及有害元素的残留分析提供参考依据。

1 材 料

1.1 仪器 电感耦合等离子质谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)；CEM mars5 express微波消解仪(美国培安公司)；XP504电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q Reference超纯水处理系统(美国密理博公司)。

1.2 试剂和药品 单元素溶液对照物质：Li(批号20041435)、B(批号20070135)、Al(批号2018122203)、Si(批号20070735)、K(批号20041435)、Ca(批号20070135)、V(批号20041435)、Cr(批号20041435)、Fe(批号20041435)、Co(批号20041435)、Ni(批号20041435)、Cu(批号19052735)、As(批号18111975)、Se(批号20041435)、Mo(批号19052735)、Pd(批号20041435)、Sb(批号2018110803)、Ba(批号19052735)、Pb(批号18081073)购自钢研纳克检测技术股份有限公司。65%硝酸购于德国默克公司，盐酸购于上海国药化学试剂有限公司。

氯化铵棕色口服溶液由苏州大学附属第一医院制剂室提供，批号分别为20190724(编号S1)、20190909(编号S2)、20191014(编号S3)、20191021(编号S4)、20191029(编号S5)、20191104(编号S6)、20191111(编号S7)、20191118(编号S8)、20191125(编号S9)、20191202(编号S10)、20200205(编号S11)、20200217(编号S12)、20200302(编号S13)、20200330(编号S14)、20200413(编号S15)、20200511(编号S16)。

2 方 法

2.1 仪器参数 射频功率1550 W，蠕动泵40 r/min，冷却气、辅助气、雾化气流量分别为14、1.0、0.989 8 L/min，延迟时间60 s，采样深度5.00 mm，扫描次数为45次，积分时间0.02 s，重复测定次数为3次。按照同位素丰度表推荐的质量数选择测定时选取的同位素，分别为：7Li、11B、27Al、29Si、39K、40Ca、51V、52Cr、57Fe、59Co、60Ni、63Cu、75As、77Se、95Mo、105Pd、121Sb、137Ba、208Pb，其中7Li、11B、27Al、29Si、39K、40Ca以45Sc为内标，51V、52Cr、57Fe、59Co、60Ni、63Cu、75As、77Se、95Mo以72Ge为内标，105Pd、121Sb、137Ba以125Te作为内标，208Pb以209Bi为内标。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品储备液 分别精密吸取Li、B、Al、V、Cr、Fe、Co、As、Se、Mo、Pd、Sb、Ba、Pb、Ni和Cu单元素溶液对照物质1 ml；Si、Ca和K单元素溶液对照物质10 ml，置100 ml容量瓶中并稀释至刻度，摇匀，得多元素对照品储备液[3]。

2.2.2 内标溶液 分别精密吸取Sc、Ge、Te、Bi单元素对照溶液250 μl，用5%硝酸溶液稀释，制成每1 ml含Sc 50 ng，Ge 50 ng，Te 50 ng，Bi 50 ng的混合对照溶液。

2.2.3 供试品溶液 精密量取氯化铵棕色口服液1 ml，置耐压耐高温聚四氟乙烯消解罐内，加5 ml硝酸消解，放置过夜，盖好内盖，旋紧外套，置微波消解炉内进行消解。消解完全后，待消解液冷却至60 ℃以下，取出消解罐，放冷，将消解液转入50 ml量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入1 μg/ml金(Au)对照溶液200 μl，用水稀释至刻度，摇匀，即得。除不加Au对照溶液外，同法制备空白溶液。测定钾(K)元素时样品溶液预先稀释100倍再行测定[4-5]。

2.3 方法学考察[6-7]

2.3.1 线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下混合对照品储备液适量，用2%硝酸溶液稀释，制成混合标准曲线对照品溶液，其中Li、B、Al、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Se、Mo、Pd、Sb、Ba、Pb的系列浓度为 0、1、2、10、25、50 ng/ml，Si、Ca、K的系列浓度为0、50、100、250、500、1000 ng/ml。

按2.1项下仪器参数，依次将仪器的样品管插入各个浓度的对照品溶液中进行测定，以各个测定元素响应值和对应的内标响应值的比值为纵坐标，其浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程与线性范围见表1。

表1 19种元素的线性、精密度、重复性、稳定性、检出限以及定量限测定结果Table 1 Determination results of linearity,precision,repeatability,stability,detection limit and quantitation limit of the 19 elements

2.3.2 精密度试验 取线性关系中标准曲线第4个浓度点的对照品溶液，连续进样6次，按上述方法测定，根据测得值计算供试品中待测元素的RSD。结果Li、B、Al、Si、K、Ca、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Se、Mo、Pd、Sb、Ba和Pb的RSD均≤2.36%(n=6)，表明仪器精密度良好(见表1)。

2.3.3 重复性试验 精密吸取氯化铵棕色口服溶液样品1 ml(编号S1)，按2.2.3项下方法制成6份供试品溶液，按2.1项下仪器参数条件测定，根据测得值计算RSD，结果Li、B、Al、Si、K、Ca、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Se、Mo、Pd、Sb、Ba和Pb的RSD均≤2.88%(n=6)，表明该方法重复性良好(见表1)。

2.3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液(编号S1)，按2.1项下仪器参数条件测定，在3 h内间隔30 min连续测定6次，根据测得值计算RSD，结果Li、B、Al、Si、K、Ca、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Se、Mo、Pd、Sb、Ba和Pb的RSD均≤3.02%(n=6)，表明供试品溶液稳定性良好(见表1)。

2.3.5 加样回收率试验 取同一批次样品(编号S1)1 ml，精密称取，置聚四氟乙烯消解罐内，精密加入多元素混合对照品储备液适量，按2.2.3项下方法制备溶液，按2.1项下仪器参数条件测定，计算回收率，结果Li、B、Al、Si、K、Ca、V、Cr、Fe、Co、Ni、Cu、As、Se、Mo、Pd、Sb、Ba和Pb的平均加样回收率分别为(87.66±2.14)%、(93.54±2.88)%、(87.44±2.01)%、(89.58±3.09)%、(96.38±3.17)%、(85.86±2.64)%、(91.47±3.38)%、(94.27±3.41)%、(90.25±2.97)%、(93.77±2.54)%、(94.52±1.47)%、(93.58±2.07)%、(91.47±2.44)%、(93.57±2.46)%、(94.74±2.31)%、(89.57±2.42)%、(89.69±3.07)%、(93.22±2.77)%和(92.11±1.55)%(n=6)，表明此方法准确性良好。

2.4 检测限以及定量限 在最佳实验条件下，测定不少于7份的空白样品溶液，以连续测定空白样品溶液响应值的3倍标准偏差(3SD)所对应的待测元素浓度作为检测限；以连续测定空白溶液响应值的10倍标准偏差(10SD)所对应的待测元素浓度作为定量限，测定结果见表1。

2.5 样品含量测定 精密量取16个批号的氯化铵棕色口服溶液(编号S1～S16)，按2.2.3项下方法制备溶液，按2.1项下仪器参数条件测定，结果见表2。19种测定元素的含量差别较大，Co、Cu、Se、Mo、Pd、Sb、Ba以及Pb等含量较小，Si、K以及Ca含量较高，其他元素含量波动较大，且不同批次的样品中存在一定的差异，如Fe最高含量为2 333 ng/ml，最低1 340 ng/ml。测定结果根据《ICH Q3D元素杂质指导原则》中规定的最大暴露量折算，远小于规定的元素杂质的每日允许暴露量[8]，说明基于元素考虑，本制剂较为安全。

表2 氯化铵棕色口服溶液中19种无机元素的含量测定结果Table 2 Content determination results of the 19 inorganic elements in the Ammonium chloride brown oral liquid (n=3，ρB/ng·ml-1)

利用SIMCA-P 13.0软件， 对不同批次氯化铵棕色口服溶液样品中无机元素含量进行主成分分析和偏最小二乘判别分析，主成分分析得分散点图见图1。结果表明不同批次间具有一定的差异，样品S1、S2、S3和S4聚集为一类(A)，样品S5、S6、S7、S8和S9聚集为一类(B)，样品S10、S11、S12、S13聚集为一类(C)，其余样品聚集为一类(D)，含量不同的具体原因可能是由于每一批次的原料来源不同。

图1 不同批次氯化铵棕色口服液的主成分分析得分图Figure 1 Principle component analysis score diagram of different batches of the Ammonium chloride brown oral liquidA:样品S1～S4;B:样品S5～S9;C:样品S10～S13;D:样品S14～S16

利用偏最小二乘判别分析，并结合t检验(P<0.05)进一步对不同批次氯化铵棕色口服溶液差异元素进行比较，按照变量对分组的贡献值(VIP)的大小进行排列。其中Li、B、K、V、Fe、Ni、As、Mo、Pd元素的VIP>1，表明这几种元素在不同批次氯化铵棕色口服溶液中的含量差异较大(见图2)。

3 讨 论

在19种待测元素中，Fe、Ni、Mo是人体必需的微量元素，Co对人体具有一定的毒性，Ni和Ca属于微量元素，过量具有一定的毒性；Se是有益的营养元素；Cu、As、Pb属于有害元素。本研究结果发现，19种元素均有检出，通过主成分分析和偏最小二乘判别分析，发现微量元素之间均有一定的差异。

主成分分析发现样品分别聚为四类，具体原因可能是由于原料来源和批次不同。

本研究对氯化钠棕色口服溶液中重金属及其有害元素的含量进行测定，旨在消除公众对于中药有害物质的恐慌和误解。《ICH Q3D元素杂质指导原则》中的风险评估模型计算简便，灵敏度极高，适用于重金属元素的分析评估。本研究测定结果换算成每日最大暴露量，远小于该指导原则中规定的每日允许暴露量。重金属有害元素风险评估结果表明，基于元素杂质限度考虑，本复方制剂较为安全。