实验设计（DOE）确定快速水分测定仪的参数设置

郭荣志 孙 宾 徐春燕

（云南雷允上理想药业有限公司，云南 昆明 650503）

0 引言

制药行业药典规定了5种水分测定方法。常用烘干法“供试品在100～105℃干燥5h，放冷30min，精密称定，再干燥1h，再放冷称重，后计算2次重量以计算供试品水分”。该方法简便、易操作、准确、重复性好，但用时长[1]。

生产中控须快速、及时，通常采用快速水分测定仪测水分。该方法快速，能在10min内得出结果，然而准确性和重复性较差。

研究发现快速水分测定仪结果与仪器参数设置有很大关系，若按药典温度设置，则与实验室药典方法的结果差异较大。现对水分测定仪的参数设置研究，以期望现场检测值与实验室检测值接近。

1 试验计划

试验供试品：云南雷允上理想药业有限公司肾衰宁胶囊总混颗粒。

试验仪器：梅特勒托利多HE53型卤素水分测定仪（见图1），2019年采购，Ⅱ级检定合格。可设置参数：干燥温度范围50℃～160℃、测定结束模式5级（平均失重低于数值就触发干燥结束并得出测定结果，1mg/10s、1mg/20s、1mg/50s、1mg/90s、1mg/140s）。

图1 HE53型卤素水分测定仪

试验设计计划研究得知参数温度须>135℃，“测定结束模式”可能在3级、4级。

运用Minitab进行两水平试验设计因子数2，中心点3，角点仿行数1，区组1，因子为温度（连续性变量，类型数字，135℃，145℃）、模式（非连续变量，类型文本，模式3（1mg/50s）；模式4（1mg/90s）），得出试验计划为10次。注：为保证精密，同批现场测定2次。表1为试验计划和数据结果表[2-3]。

2 数据处理及结果分析

2.1 数据结果

数据结果见表1。连续10批次，在现场使用快速水分测定仪测定2个样本，填入“现场”列，取样送实验室得实验室列数据，注：接近度=现场÷实验室。

表1 试验计划和数据结果表

2.2 数据分析

首先分析因子设计，残差图呈“喇叭状”，对响应进行最优取整λ的Box-Cox变换（注：Box-Cox变换是方幂变换，λ是变换系数，比如变换模型Y=X2中λ=2），发现弯曲P值0.001，显示存在弯曲，须增加二次项。

先尝试不增加额外实验的响应曲面设计，连续因子温度，类别因子模式，根据表1指定标准顺序列、运行顺序列、中心点、区组，分析响应曲面设计，响应：接近度；项：A温度；B模型；AA；AB；结果回归效果非常不好R-sq=46.25%、R-sq（调整）=31.92%，残差图正态概率P值＜0.005。在分析响应曲面设计选项中勾选Box-Cox变换“最优取整λ（M）”（即最优的变换系数，使变换后数据正态性最好）。结果及分析如下。

2.2.1 方差分析及效果显著性

见表2，模型P值=0.000，模型有效；因子温度、模式和平方项“温度×温度”P值均≤0.05，效应显著；交互项“温度×模式”P值=0.050，效应基本显著；失拟P值0.217，不存在失拟。

表2 变换的响应的方差分析

2.2.2 回归效果

R-sq=86.96%，R-sq（调整）=83.48%，两者接近且≥80%，模型基本可以预测。

2.2.3 回归方程

回归方程均由软件自动计算，故略。

2.2.4 残差诊断

残差是观测到的响应变量数据与带入回归模型后的预测值之差。残差诊断目的是基于残差的状况来诊断模型是否合适，假定数据相互独立，残差符合正态分布。实验情况见图2。正态概率图(左上)。残差是指实际观察值与拟合值之间的差，因本例输出指标为接近度百分比，因此无单位；N为样本数；AD为Anderson-Darling拟合优度检验，是一种检验所收集数据是否服从正态分布的非参数检验方法；P值是用来判定假设检验结果的参数。该图看残差是否符合正态分布，P值0.522＞0.05，数据符合正态分布。残差与顺序的散点图(右下)。顺序：观察值出现的顺序。该图考察各点是否随机地在水平轴上下无规则地波动（即时间顺序上无显著异常影响），图中各点随机在水平轴上下无规则波动。残差与拟合值的散点图(右上)。拟合值：变量输入拟合模型的输出值。该图考察残差是否保持等方差性（即不同变量水平对应的输出拟合值波动无显著异常变化），比如是否有“漏斗型”或“喇叭型”，该图疑似“喇叭状”，但已是λ变换后的结果，可能与固有实验误差较大有关。注：直方图（左下）。频率：数值出现次数÷数据总数。

图2 接近度残差图

2.3 结果预测与验证

2.3.1 预测

见图3，确实有弯曲，超过拐点后，现场与实验室的检测值差异又增大。最佳设置模式4、温度139.923℃（为便于实际设置取整为140℃），并得到95%预测区间（0.879056，1.36163），见图4。注：95%预测区间，按此设置，后续任何一次检测值将落入的区域，是将来验证试验时将要落入的范围，可作为验证试验时的标准。

图3 优化预测图

图4 多响应预测

2.3.2 验证

目的是验证预测设置的实际效果。按模式4、140℃设置，对连续5批次肾衰宁胶囊总混颗粒测试。数据见表3，所有5批次现场与实验室检测的接近度均在95%的预测区间内，预测正确，设置可行。

表3 验证数据表

3 结论

结论：对肾衰宁胶囊总混颗粒，经试验设计确定水分测定仪的参数设置为温度140℃，测定结束模式4（1mg/90s）。在该设置下，可以确保现场与QC的测试结果差异约±15%，表明现场中控检测具备一定的准确性。

讨论1：实验设计的原则包括完全重复、区组化、随机化。其中完全重复非常重要，若只对少批次重复，会造成拟合无法包括整体波动水平，R-sq和R-sq（调整）拟合不好。试验设计时，因子上下水平过窄，当存在弯曲时，可能未包括弯曲点，即无法找到最优设置，会造成预测不准，验证试验失败。

该实验设计中，Minitab计划实验10批次，实际每批测试2次，不采用平均值，而是把计划表每行进行复制，使2个实际测试值都填入表，这是因为快速水分测定方法重复性较差，若平均则加大了实验误差，见表1。经询问相关统计专家，得知这样做可能把实验误差估计小了。但实践发现，这样恰恰适用于实验误差本身较差的检测方法。

讨论2：该实验设计得到模型的R2（R是相关系数，即输入因子与输出指标存在相关性的参数，R-sq是R2）仅大于80%一点点，原因一可能为数据分析时，直接尝试不增加额外实验的响应曲面设计分析，虽然得到了预测结果，但是并非实际意义的响应曲面分析，按理论需要补充一部分试验，但由于作者对实验设计还处于初学阶段，还无法掌握相对复杂的追加试验的方法，但从图3上看，拐点基本上位于左右区间的中央，说明试验水平范围刚好使拐点在中心左右，因此，无须追加试验。原因二为本身快速水分测定方法重复性差，也就是这种快速方法固有的试验误差相对较大，即使通过合理设置缩小范围，但也无法像药典方法一样的准确和精密，重复性低至5%以内。

讨论3：快速水分测定仪的参数设置，因物料不同可能存在差异。通过实验设计得出的参数并验证成功后，日常中控现场与QC的检测结果出现连续差异、超出95%预测区间，就可能提示生产工艺异常。因为实验设计预测的参数，是基于实际实践、科学得出的模型，一旦模型失效，一种情况是参数设置偏离，另一种情况是实际物料与实验设计物料已有明显差异。