奇异根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa不同分离株的生物学特性研究

余凤玉，唐庆华，朱 辉，宋薇薇，牛晓庆，杨德洁

(中国热带农业科学院椰子研究所/院士团队创新中心/椰子国家工程研究中心，海南文昌，571339)

奇异根串珠霉菌Ceratocystisparadoxa属于根串珠霉属，在热带地区分布极为广泛，可侵染为害大部分棕榈科植物，是影响棕榈科植物建康发展的重要病原菌[1-2]。该菌可为害椰子CocosnuciferaL.、布迪椰子Butiacapitata(Mart.) Becc.、三角椰子Dypsisdecaryi(Jum.) Beentje & J.Dransf.、棍棒椰子HyophorbeverschaffeltiiH.Wendl.、油棕ElaeisguineensisJacq.、椰枣PhoenixdactyliferaL.等棕榈植物，引起茎干泻血、茎干腐烂、冠腐、芽腐、叶片焦枯、果腐等症状，严重的整株死亡[3-9]。目前，在海南省椰子种植区普遍发生由奇异根串珠霉菌为害引起的棕榈植物病害，其中以为害椰子引起茎干泻血和茎干腐烂最为严重，发病率40%以上，死亡率超过5%[8，10]；至今尚无十分有效的防治方法，给海南省椰子等棕榈植物的生产及推广应用造成严重威胁和损失，已成为棕榈科植物生产及推广应用急需解决的问题。

奇异根串珠霉菌为土壤习居菌，其厚垣孢子可在土壤中长期存活并广泛传播。自1906年首次在斯里兰卡发现奇异根串珠霉菌引起椰子泻血病以来，已有110多年的历史，国内外学者在奇异根串珠霉菌引起棕榈植物病害的发生分布[4，8-10]、化学药剂筛选、生物防治[5，11-18]等多方面进行了卓有成效的研究，取得了积极进展。但由于不了解病原菌致病性分化情况，影响了人们对该病原菌侵染条件及为害情况的认识，制约了对该病原菌引起病害的防治、预测预报和寄主抗病性等方面的研究，至今尚未找到十分有效的奇异根串珠霉菌病害防治方法。因此，本研究对椰子树不同部位分离到的3株菌落特征差异显著的分离株进行其生物学特性研究，以便为研究阐明奇异根串珠霉菌致病力和遗传多样性，及病害防治策略制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株的采集、分离

从海南省文昌市椰子树上表现心部腐烂、茎干腐烂和树冠基部腐烂的部位采集病样，按常规组织块分离法[19]分离病原菌，获得单菌落后保存菌种，选择在PDA培养基平板上菌落特征差异明显的3株分离株BR2、TR924和GF924作为研究对象。

1.2 培养性状观察

将分离株BR2、TR924和GF924用打孔器(直径5mm)从菌落边缘取菌碟，无菌条件下移入PDA培养基平板中央置于25 ℃恒温培养箱中培养，2 d后观察记录菌落形状、颜色、气味及气生菌丝生长情况。

1.3 温度对菌丝生长和产孢量的影响

将分离株BR2、TR924和GF924在PDA培养基上培养2 d后，用打孔器(直径5 mm)从菌落边缘取菌碟，无菌条件下移入PDA培养基平板上，分别置于5、10、15、20、25、30、35和40 ℃恒温条件下培养，2 d后用十字交叉法测量菌落直径；7 d后分别用30 mL无菌水洗涤平板，制成孢子悬浮液，然后在显微镜下用血球计数板计量孢子浓度。每处理重复6次。

1.4 碳氮源对菌丝生长和产孢量的影响

以查彼克培养基(Czapek)为基础培养基，将分离株BR2、TR924和GF924置于不同碳源和氮源培养基，即分别以等量的D-果糖、甘露醇、D-半乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、海藻糖置换其中的蔗糖，以等量的硝酸钾、脲、硫酸铵、磷酸二氢铵、硝酸铵、氯化铵置换其中的硝酸钠，以Czapek培养基为对照，不加碳源和不加氮源为空白对照，每处理重复6次，25 ℃恒温培养箱中培养。按照1.3的方法测量菌落直径和计算孢子数。

1.5 pH值对菌丝生长和产孢量的影响

分别用HCl 1 mol/L和NaOH 1 mol/L溶液在无菌条件下将PDA培养基的pH值调节到4、5、6、7、8、9、10、11共8个处理，将直径5 mm菌碟接种于不同pH值平板中央培养，25 ℃下恒温培养，每处理重复6次。按照1.3的方法测量菌落直径和计算孢子数。

2 结果与分析

2.1 培养性状

分离得到的3个菌株在PDA培养基平板上生长迅速，2 d后均长满整个培养皿(直径90 mm)，气生菌丝发达，有浓郁的水果香味。初期菌丝体白色，稀疏放射状，后从中央开始随着厚垣孢子的产生而呈黑色。生长7 d后发现存在3个菌落特征差异明显的菌株BR2、TR924和GF924。其中分离株BR2气生菌丝茂盛松软，厚，棉絮状；分离株TR924气生菌丝茂盛，较松软，羽绒状；分离株GF924气生菌丝较为致密，绒毛状(见图1)。

图1 奇异根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa3株分离株PDA培养基培养7 d后的培养性状

2.2 温度对菌丝生长和产孢量的影响

从图2可以看出，分离株BR2、TR924和GF924的菌丝15～35 ℃均可以生长，30 ℃时菌丝生长速率下降。BR2和GF924最适生长温度为25～30 ℃，TR924菌丝最适生长温度为25 ℃。3株分离株在20～30 ℃范围内生长速率存在差异，GF924的生长速率极显著低于另2株分离株。

图2 温度对奇异根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa 3株分离株菌丝生长和产孢量的影响

分离株BR2、TR924和GF924在10～35 ℃范围内均可以产孢。10～25 ℃，分离株TR924和GF924产孢量均呈上升趋势。分离株BR2在20 ℃时的产孢量显著低于15 ℃，10～25 ℃范围内其产孢量呈先升后降再升的趋势；10～30 ℃范围内BR2的产孢量均极显著高于另外2株分离菌。

2.3 碳氮源对菌丝生长和产孢量的影响

从表1可以看出，3株分离株均可在查彼克培养基(对照)上生长，在可溶性淀粉为碳源的培养基上生长最快。3株分离株在供试培养基上均可以产孢，其中，分离株BR2和GF924在可溶性淀粉为碳源的培养基上产孢量最大，而分离株TR924在甘露醇为碳源的培养基上产孢量最大。综合菌丝生长和产孢量可知，分离株BR2和GF924菌丝生长及产孢的最适碳源均是可溶性淀粉；分离株TR924菌丝生长最适碳源是可溶性淀粉，最适产孢碳源是甘露醇。

表1 碳氮源对奇异根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa 3株分离株菌丝生长和产孢量的影响

分离株BR2、TR924和GF924在无氮源培养基上均能生长和产孢。供试氮源中，菌丝生长的最适氮源均为氯化铵，生长速率显著高于其他供试氮源。分离株BR2最适产孢氮源是硝酸钾，TR924和GF924在查彼克培养基(对照)上产孢量最大。3株分离株在脲为氮源的培养基上均不能产孢。氯化铵虽然最适合TR924菌丝生长，但却不能使其产孢。

2.4 pH值对菌丝生长和产孢量的影响

从表3可以看出，在pH值4～11范围内，分离株BR2、TR924和GF924均能很好地生长和产孢。其中，分离株BR2菌丝生长和产孢的最适pH值分别是5和6，产孢量达到(40.83±6.12)×107/皿；分离株TR924菌丝生长最适pH值为5～7，最适产孢pH值为6；分离株GF924菌丝生长最适pH值为6，最适产孢pH值是10～11。

表3 pH值对奇异根串珠霉菌Ceratocystis paradoxa 3株分离株菌丝生长和产孢量的影响

3 结论与讨论

本文从椰子不同部位分离获得3株奇异根串珠霉菌分离株。试验结果表明，3株分离株菌丝在15～35 ℃范围均可以生长，但分离株TR924在30 ℃时菌丝生长速率开始下降，说明该分离株对高温的耐受性较差，这与其引起的海南椰子树茎干腐烂病只在冬春季流行相吻合，说明温度是影响椰子树茎干腐烂病流行暴发的关键生态因子。研究结果表明，分离株BR2和GF924菌丝生长及产孢的最适碳源均是可溶性淀粉；分离株TR924菌丝生长最适碳源是可溶性淀粉，最适产孢碳源是甘露醇。菌丝生长的最适氮源均为氯化铵，生长速率显著高于其他供试氮源。分离株BR2最适产孢氮源是硝酸钾，TR924和GF924在查彼克培养基上产孢量最大。3株分离株在无氮培养基上均能生长和产孢，说明这3株分离株有高效的氮代谢途径[20]。碳氮源是病原菌生长的基本物质，研究不同碳氮源对病原菌生长的影响，是系统研究病害发生规律的重要内容之一，对病害防控有指导意义[21-22]。3株分离株在pH值4～11的范围内均能很好地生长和产孢，但不同分离株间存在差异。菌丝生长最适pH值均为弱酸性，而产孢对酸碱性适应性差异显著，GF924在强碱性条件下产孢量最大，弱酸性最适合另2株分离株产孢，说明从不同部位分离获得的分离株有性繁殖对酸碱性的适应性不一样。奇异根串珠霉菌是土壤习居菌，土壤pH值环境影响其定殖和侵染。本文研究结果显示奇异根串珠霉菌在pH值4～11的范围内均能很好地生长和产孢，但对其致病力还有待进一步研究，以期通过改良土壤pH值来防控奇异根串珠霉菌引起的病害。