补骨脂种子提取物对苹果腐烂病菌的抑菌活性研究

安 澜，关丽杰

(沈阳化工大学，沈阳，110142)

苹果是世界上最重要的商品化栽培和适应性强的温带果树之一[1]。我国是世界第一大苹果生产国，产量约占全球50%。苹果树在生长发育阶段会受到真菌、细菌、病毒等病害的威胁[2]。苹果腐烂病ValsamaliMiyabe et Yamada.又称烂皮病，是苹果树上最严重的病害之一[3]，病菌除危害树干外，也能侵染果实[4]，是限制我国苹果产量和品质的重要因素，严重时可导致死树和毁园[5]。化学药物防治是防治苹果腐烂病的主要手段[6]，常用的药剂有丁香菌酯、戊唑醇、苯醚甲环唑等[7-9]。其中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂20%丁香菌酯悬浮剂对苹果腐烂病菌有较高的离体抑制活性，在田间采用刮疤处理再进行药剂涂抹能有效地抑制苹果腐烂病病疤的复发，对病疤的愈合有较好的促进效果[10]；三唑类杀菌剂戊唑醇能抑制苹果腐烂病菌菌体麦角甾醇的生物合成而影响菌丝生长、孢子萌发和病斑的扩展[11]；苯醚甲环唑同为三唑类杀菌剂[12]，对苹果腐烂病菌虽有较好的抑菌作用，但田间防效不如戊唑醇，其原因可能是由于该药剂作用位点单一，长期反复使用会引起病菌产生抗药性[13]。补骨脂种子提取物是一种植物源杀菌剂，苯丙烯菌酮是其主要活性成分之一[14]，其对水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜炭疽病菌等11种植物病原菌有较好的抑制活性[15]，0.2%苯丙烯菌酮微乳剂在田间对水稻稻瘟病和水稻纹枯病也有很好的治疗效果[16-17]。本研究采用菌丝生长抑制率和孢子萌发抑制率法测定补骨脂种子提取物对苹果腐烂病菌的抑制活性并通过田间试验验证，为其在田间示范推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

供试菌种为沈阳化工大学生物工程教研室保存的苹果腐烂病ValsamaliMiyabe et Yamada.病菌。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 试验仪器 试验所用仪器主要有SPX-250B-Z 生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产)、SW-CJ-IG 单人净化工作台(苏州净化仪器有限公司生产)、LDZX-40BI 立式自动电热压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂生产)、SCOUT 电子天平SCA210(臾豪斯国际贸易有限公司生产)、TSQ-280振荡培养箱(上海精宏试验设备有限公司生产)、CX33生物显微镜(山东省济南市历城区济南来宝医疗器械有限公司生产)、迷雾气候箱、精确喷雾器等。

1.2.2 供试药剂 补骨脂种子提取物(含2%苯丙烯菌酮，沈阳同祥生物农药有限公司生产)；补骨脂种子提取物微乳剂(含0.2%苯丙烯菌酮，沈阳同祥生物农药有限公司生产)；20%丁香菌酯悬浮剂(吉林省八达农药有限公司生产)。

1.3 病菌抑制活性试验

1.3.1 对病菌菌丝生长的抑制作用 采用菌丝生长速率法。用丙酮将补骨脂种子提取物完全溶解后加入到PDA培养基中，制成终浓度为3.3、10、30、90、270 mg/L含药培养基。以等体积的丙酮加入到培养基中作为对照。取预先培养好的苹果腐烂病菌平板上的菌饼(直径为6 mm)，移入含有不同浓度药剂的平板和对照平板中央，每处理5个重复，置27 ℃下培养5 d，测量菌落直径并计算抑制率，采用最小二乘法计算毒力回归方程和有效抑制中浓度(EC50值)。

1.3.2 病菌孢子萌发的抑制活性 从长势良好的苹果腐烂病菌平板上切取直径为6 mm的菌饼移植于PDA平板中央，置于27 ℃下培养30 d，待形成分生孢子器后向苹果腐烂病菌平板中加2%无菌葡萄糖水5 mL，用毛刷沿一个方向刷洗苹果腐烂病菌平板表面，对洗刷下来的分生孢子器进行研磨释放出孢子，经4层纱布过滤，得到浓度为1×105～1×106个/mL的孢子悬液。

将补骨脂种子提取物配制成浓度为3.3、10、30、90、270 mg/L的丙酮溶液，然后分别取10 μL上述药液和190 μL的孢子悬液至24微孔板，使得药剂终浓度为0.165、0.5、1.5、4.5、13.5 mg/L，每处理3个重复，另设空白对照。将各处理置27 ℃恒温下培养，每隔2 h镜检观察孢子萌发的情况，苹果腐烂病菌分生孢子为香肠形，但萌发时一般先膨大变形，以孢子是否膨大变形为萌发标准，当对照组孢子萌发率达到90%时，每处理随机选取200个孢子统计孢子萌发数目并计算萌发抑制率。

1.4 田间防效试验

1.4.1 试验地点及环境条件 试验地位置在陕西省咸阳市乾县薛录镇新丰村。试验苹果树树龄为20年，品种为富士，生长良好。试验地为土娄土，呈中性，每667 m2施复合肥100 kg，浇水一次。无试验地病虫害发生情况及药剂使用情况。

1.4.2 试验设计和安排 供试药剂处理见表1。

表1 供试药剂试验设计

1.4.3 小区安排 采用随机区组设计，单个小区共5株树，当年新生病疤8个以上，每处理重复4次。

1.4.4 施药方法及时间 采用刮疤涂抹法，首先用刀刮净腐烂病病斑及周缘少量健康组织切成梭条形茬，然后将药剂按比例稀释搅拌均匀，轻轻用毛刷将药液均匀涂于皮茬切口处及周围皮层。试验于2019年4月7日涂抹病疤一次，共施药一次。

1.4.5 调查方法 于2019 年4月7日施药前进行基数调查， 2020年4月1日发病盛期后进行药效调查，共调查2次。药前调查病疤块基数，药后调查各小区全部试验树的新生病块数和旧病疤的复发情况，统计各小区平均每株新病块数和旧病疤复发率。

2 结果与分析

2.1 对病菌菌丝生长的抑制活性

补骨脂种子提取物在浓度为3.3、10、30、90、270 mg/L时，采用菌丝生长速率法测定其对苹果腐烂菌的抑制活性。试验结果看出，当补骨脂种子提取物浓度为3.3、10、30、90、270 mg/L时，对苹果腐烂病菌菌丝生长抑制率分别为33.43%、49.70%、85.20%、92.60%、96.15%。一定浓度范围内随着处理浓度的增加对菌丝生长的抑制率逐渐增大，其EC50值为6.766 mg/L(见表2)。补骨脂种子提取物对苹果腐烂病菌菌丝生长具有很强的抑制作用。

表2 不同浓度补骨脂种子提取物对苹果腐烂病菌菌丝生长的抑制活性

2.2 对病菌孢子萌发的抑制活性

补骨脂种子提取物浓度为0.165、0.5、1.5、4.5、13.5 mg/L时，采用孢子萌发法，测定其对苹果腐烂病菌孢子萌发的抑制作用。试验结果看出，补骨脂种子提取物对苹果腐烂病菌孢子萌发有较强的抑制作用。当补骨脂种子提取物的浓度为0.165、0.5、1.5、4.5、13.5 mg/L时，对苹果腐烂病菌孢子萌发的抑制率分别为49.22%、71.93%、86.09%、93.04%、98.86%，说明随着补骨脂种子提取物浓度的升高，对孢子萌发的抑制作用不断增强。其EC50值为0.172 mg/L，说明补骨脂种子提取物在很低浓度下就对苹果腐烂病菌孢子萌发有较强的抑制作用(见表3)。

表3 不同浓度补骨脂种子提取物对苹果腐烂病孢子萌发的抑制活性

2.3 对苹果腐烂病的田间防效

试验结果看出，补骨脂种子提取物微乳剂200、400、600倍液及对照药剂20%丁香菌酯悬浮剂200倍液处理，药后第二年的新增病块增长率分别为2.50%、6.49%、12.11%、6.49%；平均防效分别为81.25%、75.63%、71.32%、76.67%。从新增病块增长率和平均防效来看，相同剂量的补骨脂种子提取物微乳剂均好于对照药剂20%丁香菌酯悬浮剂。对第二年的防治效果进行差异显著性分析，结果表明，在0.05水平和0.01水平上，补骨脂种子提取物微乳剂 200倍液处理与对照药剂20%丁香菌酯悬浮剂均有显著差异。经田间系统观察得知，补骨脂种子提取物微乳剂在试验剂量范围内对苹果树安全，无不良影响(见表4)。

表4 补骨脂种子提取物微乳剂防治苹果腐烂病的田间试验结果

3 结论与讨论

苹果腐烂病是苹果树生长过程中较为严重的病害，影响苹果树正常生长发育，造成苹果果实品质下降，甚至停产绝收。目前防治苹果腐烂病大多以化学农药为主。本研究采用菌丝生长抑制率和孢子萌发抑制率2种室内生测方法研究了植物源杀菌剂补骨脂种子提取物对苹果腐烂病菌的抑制活性，并通过田间试验进行验证。

通过测定补骨脂种子提取物对苹果腐烂病菌的抑菌活性，证明了其对苹果腐烂病菌菌丝生长和孢子萌发均具有较强的抑制作用。试验发现，在一定浓度范围内，补骨脂种子提取物的浓度与苹果腐烂病菌菌丝生长及孢子萌发的抑制率呈正相关，即随着浓度增大，抑制率也增大，EC50值分别为6.766、0.172 mg/L。田间防效试验表明，补骨脂种子提取物微乳剂(含0.2%苯丙烯菌酮)对苹果腐烂病有显著防治效果，其200～600倍液进行刮疤涂抹处理在第二年的防治效果达71%～81%，而且安全性好，可有效控制苹果树腐烂病的发生。同时，也可与其他不同作用机制的杀菌剂交替使用，以延缓病原菌抗药性的产生。

由于苹果腐烂病是潜伏侵染性病害，树势衰弱时就能诱发病疤复发[18]。因此，在做到合理的药物防治的同时又要对果园进行科学管理，增强树体本身的抗病性，来满足绿色果品生产的需要。