不同产地槐角HPLC指纹图谱建立及化学模式识别研究

李晶峰，杨海南，郅 慧，高 旭，杨小倩，张 辉*

不同产地槐角HPLC指纹图谱建立及化学模式识别研究

李晶峰1，杨海南2，郅 慧1，高 旭1，杨小倩1，张 辉1*

1. 长春中医药大学，吉林 长春 130117 2. 吉林北药药材加工有限公司，吉林 长春 130000

测定不同产地槐角中槐角苷、芦丁、染料木苷含量，并建立其HPLC指纹图谱，结合化学模式识别建立槐角有效的质量评价方法，为槐角药材的质量标准制定提供依据。采用Agilent Zorbax SB C18色谱柱在检测波长为260 nm，体积流量为0.6 mL/min，甲醇-乙腈-0.07%磷酸水（12∶20∶68）为流动相进行等度洗脱，并运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统结合化学模式识别技术进行数据分析，确定共有峰并筛选差异性成分。10个不同产地槐角样品的指纹图谱中有9个共有峰为特征峰，与对照图谱相似度均在0.98以上。不同产地槐角的槐角苷、芦丁、染料木苷平均含量分别为8.9%、4.2%、6.45%。聚类分析将10批不同产地的槐角分为2类，主成分分析、正交偏最小二乘-判别分析结果与聚类分析一致，并筛选出不同批次的差异性成分为9、1、2、6、3号峰，其中9、6号峰分别指认为槐角苷、染料木苷。建立了槐角的HPLC指纹图谱及化学模式识别下寻找不同产地槐角质量差异成分的方法，为全面评价槐角药材的质量提供有效手段。

槐角；HPLC；指纹图谱；槐角苷；芦丁；染料木苷；化学模式识别

槐角是豆科植物槐L.的干燥成熟果实[1]，含有黄酮及异黄酮类、皂苷类、脂肪酸及挥发油类、氨基酸、多糖等成分[2-4]，其主要活性物质为黄酮[5]。槐角对阿尔兹海默病模型小鼠认知功能障碍和神经炎症改变及胶原性关节炎有保护作用[6-7]；槐角黄酮提取物通过降低小鼠高脂血症模型中总胆固醇、三酰甘油与低密度脂蛋白的含量，同时升高高密度脂蛋白的含量来发挥其调脂作用[8]，并能抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭[9]；槐角染料木黄酮对放射导致的肠损伤具有保护作用[10]。

由于槐角的来源广泛、采收季节和加工方法不同，以及其受气候、土壤等条件的影响，化学成分的种类及含量有明显的差异，导致其功效也有一定程度的改变[11]。指纹图谱技术能够体现有效成分的整体性、稳定性，以及不同产地间的共有性图谱片段，在成分鉴别、质量控制等方面应用广泛[12-13]。化学识别方法结合中药指纹图谱信息，能够快速筛选出不同产地差异性成分，达到区分不同样品质量目的[14]。因此，本研究采用HPLC建立了10批不同产地槐角指纹图谱，通过相似度评价联合聚类分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）等化学模式识别方法比较不同产地之间的差异性，为完善槐角的质量控制提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

电子天平T-500美国双杰兄弟（集团）有限公司；超声波清洗器KS-250DE洁力美超声仪器有限公司；Water purifier超纯水机WP-UP-10上海捷惠科学仪器有限公司；低速离心机LXJ-IIB上海安亭科学仪器厂；Agilent 1260高效液相色谱仪美国Aglient公司。

1.2 试剂

甲醇（分析纯）、乙醇（分析纯）北京化工厂；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）Fisher Chemicals；磷酸（色谱纯），ANAQUA Chemicals；对照品槐角苷（批号111695-201703）、染料木苷（批号111709-201702）购自中国食品药品检定研究院（质量分数均＞98%）；芦丁（批号B20771）购自上海源叶生物科技有限公司（质量分数＞98%）。

1.3 材料

槐角收集于不同地区，经长春中医药大学张辉教授鉴定为槐L.的干燥成熟果实，槐角样品来源见表1。

表1 槐角样品信息

2 方法与结果

2.1 指纹图谱的建立

2.1.1 供试品溶液的制备 槐角粉碎过3号筛，取过筛后的粗粉1.0 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，加入70%乙醇25 mL，称定质量，超声（100 W）45 min，放冷，再次称定质量，乙醇补足质量，摇匀，吸取0.125 mL于5 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称定槐角苷、芦丁、染料木苷加甲醇配制为0.602、0.324、0.638 mg/mL的单品对照品溶液，再分别精密吸取上述对照品0.5 mL混匀，即得混合对照品。

2.1.3 色谱条件 Agilent Zorbax SB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相甲醇（A）-乙腈（B）-0.07%磷酸水溶液（C）等度洗脱，0～20 min，12% A，20% B，68% C；体积流量0.6 mL/min[1]；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长260 nm。

2.1.4 精密度试验 精密称定样品（S1），按2.1.1下方法制备供试品溶液，在“2.1.3”项下条件连续进样6次，以9号峰（槐角苷）为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果各共有峰相对保留时间的RSD值在0.07%～0.60%，共有峰相对峰面积的RSD值在0.63%～2.76%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 精密称定样品（S1），按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3”项条件下进样，分别于配制后0、4、8、12、24 h进样，以槐角苷色谱峰为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果各共有峰相对保留时间的RSD值在0.02%～0.21%，共有峰相对峰面积的RSD值在1.66%～2.68%，说明样品在24 h内稳定。

2.1.6 重复性试验 精密称定S1样品，按“2.1.1”项方法平行制备6份供试品溶液，以槐角苷色谱峰为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果各共有峰相对保留时间的RSD值在0.03%～0.66%，共有峰相对峰面积的RSD值在1.69%～2.91%，表明所用方法重复性良好。

2.1.7 指纹图谱相似度评价 取10批不同产地槐角按“2.1.1”项制备样品溶液，在“2.1.3”项条件下进样并记录色谱数据，将其导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版），多点校正得到槐角样品的指纹图谱与对照图谱并进行相似度分析，见图1和表2，共得到9个共有峰，9号峰为槐角苷，该化合物具有较好的峰形，且为槐角特征性成分，故以9号峰为参照峰，共有模式图中相对保留时间（相对峰面积）分别为0.319（0.206）、0.412（0.14）、0.443（0.083）、0.533（0.208）、0.61（0.055）、0.763（0.138）、0.825（0.046）、0.896（0.621）、1.00（1.00）。

图1 不同产地槐角药材HPLC指纹图谱

S1～S10样品的相似度均高于0.98以上，表明10批槐角药材的整体质量相对稳定，但各成分含量存在较大差异。经与对照品比对，指认了其中3种黄酮类化合物，分别为5号峰（芦丁）、6号峰（染料木苷）、9号峰（槐角苷），样品及混合对照品色谱图见图2、3。

表2 不同产地槐角药材相似度评价

图2 槐角HPLC图谱

5-芦丁 6-染料木苷 9-槐角苷

2.2 槐角药材中3种成分含量测定

测定了槐角中3种化合物的含量，为槐角药材的质量标准提供依据。其中芦丁为5,7,3',4'-四羟基-3-芸香糖黄酮，是黄酮苷类化合物[15]；槐角苷化学名称为5,7-二羟基异黄酮-4'--葡萄糖苷[16]；染料木苷为4',5,7-三羟异黄酮-7-糖苷[17-18]，与槐角苷均为异黄酮苷类化合物。

2.2.1 供试品溶液的制备 制备方法同“2.1.1”项。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 制备方法同“2.1.2”项。

2.2.3 色谱条件 方法同“2.1.3”项。

2.2.4 线性关系考察 按“2.1.3”项下色谱条件测定1、2、4、6、8、10 μL不同进样体积与峰面积的线性关系，以进样量为横坐标（），以峰面积为纵坐标（），芦丁的标准曲线为＝231.02＋4.9，2＝0.999 6，线性范围为0.201～2.010 μg；染料木苷的标准曲线为＝840.55＋29.25，2＝0.998 0，线性范围为0.108～1.080 μg；槐角苷的标准曲线为＝384＋74.12，2＝0.999 9，线性范围为0.213～2.130 μg。

2.2.5 精密度试验 取芦丁、染料木苷、槐角苷按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，3种对照品峰面积RSD值分别为1.24%、1.79%、0.48%。

2.2.6 稳定性试验 精密称定S1样品，按“2.1.3”项下色谱条件分别于0、4、8、12、24 h进样分析，记录3种黄酮化合物的峰面积，芦丁、染料木苷、槐角苷的峰面积RSD值分别为0.53%、1.42%、2.59%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 精密称定S1样品，按“2.1.1”项平行制备6份供试品溶液，进样分析，计算3种黄酮化合物的含量，芦丁、染料木苷、槐角苷含量的RSD值分别为1.49%、1.83%、2.68%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称定S1样品，加入一定量的芦丁、染料木苷、槐角苷对照品，按“2.1.1”项平行制备6份供试品溶液，进样分析，芦丁的加样回收率范围是99.26%～102.48%，RSD为2.57%；染料木苷的加样回收率范围是97.58%～102.74%，RSD为0.95%；槐角苷的加样回收率范围是98.46%～101.92%，RSD为1.36%。

2.2.9 样品测定 取10批槐角样品，按“2.2.1”项制备供试品溶液，进样分析，分别测定10批样品的芦丁、染料木苷、槐角苷含量，结果见表3，槐角药材中芦丁、染料木苷、槐角苷平均含量分别为8.9%、4.2%、6.45%。

表3 不同产地槐角药材中3种黄酮化合物的含量

2.3 基于化学模式识别对槐角药材的分析

2.3.1 聚类分析 应用SPSS 21.0软件，以指纹图谱中共有峰的峰面积为变量，对10批槐角样品数据进行聚类分析，结果见图4。对数据进行聚类分析可得：当距离刻度为25时，主要分为2大类，第1大类为安徽亳州（S1）、四川成都（S8）、吉林白山（S10）、江苏徐州（S9）、河北保定（S2）、北京（S6）、河南信阳（S3）、吉林长春（S5），说明这几个产地的槐角在成分和含量上存在相似性，从地理方面来说除吉林白山、吉林长春产地外，其他产地皆处于我国黄河与长江流域之间，在生长环境上有一定的相似性；第2大类为山东菏泽（S4）、湖北鄂州（S7）。

图4 不同产地槐角聚类分析树状图

2.3.2 PCA与正交偏最小二乘分析-判别分析（partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA） 为了更好地区分不同产地槐角质量，将指纹图谱得到的所有共有峰峰面积数据导入SIMCA 14.1软件中进行PCA[14]，由PC1（0.458）和PC2（0.303）为坐标轴构建的PCA得分散点图可以看出不同产地的槐角明显分开，如图5。在获得有效模型的基础上（2＝0.617，2＝0.914，2＝0.754），进行OPLS-DA[19-20]，见图6，OPLS-DA最大化地凸显模型内部不同组别之间的差异[21-23]，PCA、OPLS-DA结果与聚类分析相互验证，将不同产地的槐角分为2大类，见图7。结合相关的反应离子贡献度的变量权重值（VIP）进行分析，以VIP＞1筛选出差异化合物，由VIP得分图（图8）可知，贡献值较大的差异化合物为9、1、2、6、3号峰，对应的VIP值分别为1.34、1.28、1.23、1.09、1.00，见表4，其中9号峰为槐角苷，6号峰为染料木苷。

3 讨论

本实验采用了HPLC法建立了10批不同产地的槐角指纹图谱，共确定了9个共有峰，10批不同产地的槐角指纹图谱相似度均在0.98以上，表明10批槐角药材的质量相对稳定，同时建立了HPLC测定槐角药材中3种成分（槐角苷、芦丁、染料木苷）含量测定的方法。为了更好地区分药材之间的质量差异，采用了聚类分析、PCA、OPLS-DA分析，将10批槐角分为2大类，筛选出了5个差异化合物，可作为控制槐角药材质量的指标性成分，指认了其中的2个化合物，分别为槐角苷（9号峰）、染料木苷（6号峰），均为异黄酮苷类化合物。

图5 不同产地槐角PCA散点图

图6 不同产地槐角OPLS-DA模型验证

图7 不同产地槐角OPLS-DA散点图

图8 不同产地槐角各成分VIP图

表4 不同产地槐角各成分VIP值

本研究采用指纹图谱相似度评价结合聚类分析、PCA、OPLS-DA对不同产地的槐角进行研究，可快速筛选出不同批次槐角差异性质量标志物，分析结果一致，系统地阐明槐角药材质量特征。该方法能够有效、准确地评价不同批次槐角质量标志性成分，为槐角质量控制提供方法与依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] 中国药典 [S]. 一部. 2020: 371.

[2] 付允, 李小清, 张庆贺, 等. 槐角有效成分的研究进展 [J]. 特产研究, 2018, 40(4): 95-97.

[3] 王笑, 王雨, 张冰, 等. 槐不同药用部位本草学、化学成分和药理作用研究进展 [J]. 中草药, 2018, 49(18): 4461-4467.

[4] 张庆贺. 槐角和莲子心化学成分及生物活性的研究 [D]. 长春: 吉林大学, 2018.

[5] 王杰, 刘瑞珍, 刘东超, 等. 槐角多糖抗氧化活性研究 [J]. 食品研究与开发, 2020, 41(1): 25-29.

[6] Lee H Y, Kwon Y, Cho S H. Protective effects of theon cognitive impairment and neuroinflammatory alteration in an Aβ_1-42-infused Alzheimer's disease mouse model [J]., 2017, 17(3): 255-268.

[7] Hyoung M H, Su H H, Heung S P,. Protective effects ofextract on collagen-induced arthritisin BALB/c mice [J]., 2017, 13(1): 146-154.

[8] 陈帅, 袁崇均, 罗森, 等. 槐角黄酮衍生物制备工艺及其降脂作用研究 [J]. 中药药理与临床, 2018, 34(6): 50-54.

[9] 金浩, 余佳, 王梓瑜, 等. 槐角黄酮通过调控LncRNA FBXL19-AS1/miR-342-3p通路抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的机制研究[J/OL]. 中国中药杂志: 1-10 [2020-03-27]. https://doi. org/10. 19540/j. cnki. cjcmm. 20200302. 401.

[10] 逄志骏, 王昭维, 徐传洋, 等. 槐角染料木黄酮对放射性肠损伤的保护作用 [J]. 辐射研究与辐射工艺学报, 2019, 37(1): 36-43.

[11] 张彪, 马欣, 潘一滨, 等. 复黄片总鞣质、总黄酮及槐角苷的含量测定 [J]. 西北药学杂志, 2017, 32(6): 740-744.

[12] 王金艳, 冯娜, 刘艳芳, 等. 灵芝抱子粉中麦角举醇的测定分析及其脂溶性成分指纹图谱田[J]. 菌物学报, 2018, 37(9): 109-117.

[13] 张剑霜, 喻浩, 钟欣, 等. 冬虫夏草水提物HPLC指纹图谱及模式识别分析[J]. 食品工业科技, 2018, 39(22): 219-224.

[14] 姚广哲, 马文娟, 贾琪, 等. 东北苦菜UPLC指纹图谱建立及化学模式识别 [J]. 中成药, 2020, 42(2): 392-396.

[15] 张庆贺. 槐角和莲子心化学成分及生物活性的研究 [D]. 长春: 吉林大学, 2018.

[16] 王剑波. 陕西槐角的资源、品质、化学成分及其生物活性研究 [D]. 西安: 陕西师范大学, 2012.

[17] 唐于平, 楼凤昌, 马雯, 等. 槐果皮中的异黄酮甙类成分 [J]. 中国药科大学学报, 2001, 32(3): 23-32.

[18] 马磊, 楼凤昌. 槐角中的抗癌活性成分 [J]. 中国天然药物, 2006, 4(2): 151-153.

[19] 王容, 魏屹, 周春岚, 等. 基于指纹图谱结合化学计量法对乌头属藏药材榜那的多指标成分分析 [J]. 中草药, 2020, 51(11): 3037-3044.

[20] 邱俊娜, 张榆, 张双, 等. 基于HPLC指纹图谱结合化学模式识别及定量测定的夏枯草质量控制研究 [J]. 中草药, 2020, 51(10): 2842-2850.

[21] 李之帅. 利用代谢组学方法筛选肝外胆管癌血浆诊断标志物的初步研究 [D]. 上海: 第二军医大学, 2014.

[22] 程明川, 姜川, 杨宇, 等. 基于高分辨质谱和代谢组学分析方法的白酒成分分析和香型鉴别 [J]. 环境化学, 2016, 35(12): 2618-2621.

[23] 田晓君. 基于脾肾阳虚证代谢综合征大鼠模型血清代谢组学研究 [D]. 沈阳: 辽宁中医药大学, 2016.

Establishment of HPLC fingerprint and chemical pattern recognition offrom different cultivation places

LI Jing-feng1, YANG Hai-nan2, ZHI Hui1, GAO Xu1, YANG Xiao-qian1, ZHANG Hui1

1. Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China 2. Jilin Beiyao Medicine Processing Co., Ltd., Changchun 130000, China

To determine the content of, rutin and genistein infrom different cultivation places, and establish their HPLC fingerprint. Combined with chemical pattern recognition, an effective quality evaluation method ofwas established to provide basis for the quality research of.The ethanol extract ofwas eluted on Agilent Zorbax sb C18column at the detection wavelength of 260 nm and the flow rate of 0.6 mL/min. The mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-0.07% phosphoric acid water (12∶20∶68). The similarity evaluation system of chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicine and chemical pattern recognition technology were used for data analysis to determine the common peaks and screen the different components.Nine common peaks were characteristic peaks in the fingerprints of 10samples from different cultivation places, and the similarity with the control fingerprint was more than 0.98. The average contents of Sophoricoside, rutin and genistein infrom different habitats were 0.89%, 0.42% and 6.45%, respectively. The results of principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis were consistent with those of cluster analysis. The difference components of different batches were selected as 9, 1, 2, 6 and 3, among which peaks 9 and 6 refer to Sophoricoside and genistein respectively.In this paper, HPLC fingerprint and chemical pattern recognition method were established to find the quality difference components offrom different habitats, which provided an effective means for comprehensive evaluation of the quality of.

; HPLC; fingerprint; sophoricoside; rutin; genistein; chemical pattern recognition

R286.2

A

0253 - 2670(2021)21 - 6677 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.026

2021-05-06

吉林省地方药材标准化项目-炒槐角（PZ-2016-71）

李晶峰（1989—），女，博士，研究方向为中药化学。Tel: 15834638882 E-mail: lijingfeng8161@163.com

张 辉（1958—），男，学士，教授，研究方向为中药化学。E-mail: zhanghui_8080@163.com

[责任编辑 时圣明]