中药贴膜对兔膝骨性关节炎关节软骨下骨BMP-2蛋白表达的影响

徐英杰，尹羽薇，赵海燕*，付新，董清平，孙羽佳，张宇驰

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为主要病理特征的慢性骨关节疾病，本病没有明显的种族和地域差异，在超过50岁以上人群中，仅次于心血管疾病排名第二[1]。本病是老年人膝关节疼痛、活动不便的主要原因之一，随着社会老龄化进程不断加剧，本病的发病率及发病绝对人数与日俱增[2]。在前期实验证实中药贴膜能够有效治疗膝关节骨性关节炎的基础上[3]，本实验应用免疫组化和Western blot两种方法，检测运用不同方法治疗兔膝骨性关节炎模型后关节软骨下骨BMP-2含量表达的变化，以期进一步揭示中药贴膜干预膝骨性关节炎关节退变的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年新西兰兔50只，3～4月龄，体质量2.5～3 kg，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK黑2015-003。

1.2 实验药物

中药贴膜主要成分为元胡、川芎、骨碎补、续断、冰片等，由黑龙江中医药大学实验实训中心在原中药超微粉[4]基础上制备而成。玻璃酸钠注射液：上海景峰制药股份有限公司生产(国药准字 H20000643)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制备

将白兔普通饲养1周以适应环境，并经过一般观察无异常后，采用Hulht法，建立兔右膝关节骨性关节炎模型[5]。

1.3.2 动物分组及给药方法

将造模成功的实验动物随机分为中药贴膜组、玻璃酸钠组、传统中药组、模型对照组，每组10只，另取10只健康白兔作为空白对照组。按照分组采用如下方法治疗：①空白对照组给予正常饲养不做治疗；②中药贴膜组给予中药贴膜外敷治疗，1次/日，12 h/次，共治疗6周；③玻璃酸钠组于术后1周开始行右膝关节腔内玻璃酸钠注射治疗，剂量为0.25 mL/次，1次/周，连续治疗5周；④传统中药组采用普通粉碎方法粉碎中药(药物组成与中药贴膜组相同)加入促透剂外敷治疗，1次/日，12 h/次，共治疗6周；⑤模型组给予医用橡皮膏外敷治疗，1次/日，12 h/次，共治疗6周。

1.3.3 免疫组化观察关节软骨下骨中 BMP-2含量

治疗结束后，所有动物采用空气栓塞法处死，无菌条件下取股骨内侧切口打开膝关节腔，切取右膝关节上下各1cm 厚软骨下骨质的标本。采用免疫组织化学法观察各组标本关节软骨下骨中BMP-2，具体操作步骤如下：①石蜡切片常规脱水，二甲苯脱蜡，酒精梯度水化；②3% H2O2去离子水孵育5～10 min；③PBS 2 min内3次冲洗；④滴加一抗，37 ℃孵育1～2 h，PBS 2 min内3次冲洗；⑤按照一抗的来源，分别滴加BMP-2血清单克隆抗体，37 ℃孵育30 min，PBS 2 min内3次冲洗；⑥DAB染色，蒸馏水充分冲洗；⑦酒精脱水,二甲苯透明，封片剂封片。

1.3.4 Western blot测定关节软骨下骨中 BMP-2含量表达

将各组实验动物右膝关节软骨下骨组织取出后迅速放入液氮中冷冻，按以下步骤操作：

①提取组织总蛋白:解冻标本，放入研钵，将其研碎。将研碎的骨组织放入匀浆器中，按照每20 mg组织加入100 μL RIPA裂解液。RIPA裂解液在使用前数分钟内加入PMSF，使其终浓度为1 mmol/L。在冰上匀浆，直至充分裂解。充分裂解后，4 ℃，14 000 r/min离心5 min，取上清保存于-70 ℃冰箱中。②蛋白质的定量:加2 μL超纯水于超微量紫外分光光度仪上，进行调零。擦去超纯水，加提取的蛋白质样品取2 μL，测出蛋白质浓度。③蛋白质电泳:配置10%分离胶。沿玻片用吸管加入模具中，等待凝胶聚合。加浓缩胶于分离胶之上，待浓缩胶聚合约30 min后，放置在电泳槽内，加入电泳液。按照4∶1比例(加样缓冲液)混合样品，在100 ℃条件下加热约10 min，短暂离心。连接电源，100 V约90 min，至溴酚兰到达分离胶底部。卸下玻板，小心撬开玻板，取出凝胶。④转印:浸润PVDF膜，切比PVDF膜略小的滤纸40张，润湿滤纸，移开转移装置安全盖和阴极，按顺序铺润湿滤纸20张，铺PVDF膜，铺凝胶，铺润湿滤纸20张，放置好阴极，安装转印装置，连好连接线，打开电源，25 V转印2.5～3 h，转膜后小心取出PVDF膜。⑤免疫检测:在放有转印后PVDF膜的表面皿中加封闭液，液面必须过膜，摇床上轻摇60 min，弃去封闭液，TBST洗膜3次，每次5 min，弃去TBST，摇床上温和摇动2 h后，4 ℃过夜，弃去一抗，TBST洗3次，每次5 min，弃去TBST，将膜放入一个可封口的塑料袋中加二抗，摇床上温和摇动4 h，弃去二抗，TBST洗3次，共30 min，按照DAB显色试剂盒说明配置好显色液，将PVDF膜放入显色液中显色，待条带显色清晰后用蒸馏水终止反应。

1.3.5 统计学处理方法

免疫组化结果参照前期实验所用的形态计量学研究方法研究[6]，BMP-2的表达量用细胞分数表示。蛋白印迹结果用凝胶成像分析系统取图，并分析密度，结果以目标条带的密度与内参条带的密度之比表示。

2 实验结果

2.1 免疫组化测定兔膝关节软骨下骨BMP-2表达结果

表1 免疫组化测定兔膝关节软骨下骨BMP-2表达结果

结果显示，空白对照组膝关节软骨下骨中BMP-2表达较高，模型组膝关节软骨下骨中BMP-2表达明显减低，与空白对照组性比较，P<0.01。玻璃酸钠组BMP-2表达较模型组高(P<0.01)，但低于传统中药组和中药贴膜组(P<0.01)。中药贴膜组BMP-2表达量在各治疗组中相对最高，与空白对照组接近。

2.2 Western blot测定兔膝关节软骨下骨BMP-2蛋白表达结果

表2 Western blot测定兔膝关节软骨下骨BMP-2蛋白表达结果

检测结果显示，空白对照组BMP-2蛋白表达量在各组中最高，模型组BMP-2蛋白表达量较空白对照组明显降低(P<0.01)，为空白对照组的0.29倍，玻璃酸组BMP-2蛋白表达量为空白对照组的0.42倍，较模型组增高(P<0.01)。传统中药组及中药贴膜组BMP-2蛋白表达量均较玻璃酸钠组高(P<0.05)。

3 讨论

中药贴膜由骨碎补、续断、元胡、川芎、冰片等各等分组成。方中以骨碎补为君，活血续伤，补肾强骨，《开宝本草》谓其“主破血止血，补伤折”。续断补肾强筋，疗伤续折为臣药，以助骨碎补补肾续伤之力。《本草汇言》曰：“续断，补续血脉之药也。大抵所断之血脉非此不续；所伤之筋骨非此不养；所滞之关节非此不利”。元胡活血，行气，止痛。《本草纲目》言元胡“能行血中气滞，气中血滞，故专治一身上下诸痛”；川芎活血行气，祛风止痛。《本草汇言》曰:“川芎味辛性阳，气善走窜而无阴凝粘滞之态，随入血分，有能去一切风，调一切气之功”；冰片开窍通络，《医林纂要》曰“能透骨热”，“亦能生肌止痛”。以上3味共为佐药。方中诸药合用，共奏补肾通络，续筋强骨，祛风活血之功。

现代研究证实延胡索提取物中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素都有明显的止痛作用[7]；川芎提取物中川芎嗪可促进骨折患者的骨折愈合和血肿的吸收[8]；骨碎补提取物中主要成分柚皮苷在骨性关节炎动物模型治疗过程中，具有抑制关节软骨细胞凋亡作用[9]；续断皂苷为续断提取物，其中含有使骨损伤愈合作用的活性组分，具有促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用，从而起到增强骨痂形成，改善骨小梁局部微观结构，促进骨形成的作用[10]；冰片为近乎纯粹的右旋龙脑具有良好的抗炎和透皮吸收作用[11]。

关节软骨和软骨下骨在骨性关节炎病变过程中存在既相互独立，又相互作用的关系。治疗骨性关节炎时即要注重关节软骨退变，同时也应该预防软骨下骨的发病，调节关节软骨与软骨下骨的相互生物力学作用机制，纠正关节软骨的整体生物化学环境和代谢条件。RADIN等[12]认为，软骨下骨异常在骨性关节炎发病机制中的引发重要作用，较薄的关节软骨层使其不能再分散下肢所受的应力，能量的冲击负荷应力致使软骨下骨骨小梁发生微骨折。这些骨折的修复继而会导致骨硬度的增加，致使关节局部吸收肢体传导冲击能力的减弱，关节软骨表面暴露的应力增大。FLOREA等[13]通过建立兔骨性关节炎模型并通过CT评估造模成功后膝关节软骨下骨结构改变，发现骨性关节炎动物模型软骨下骨变薄，骨小梁数量减少，蛋白聚合含量降低。

目前软骨下骨与骨性关节炎的微观结构变化的详细发病机制虽然还没有完全明确，但因为软骨下骨与关节软骨之间的密切解剖关系，决定了关节的软骨下骨在骨性关节炎发病过程中起重要作用。研究显示发生骨性关节炎病理改变时，软骨下骨处于高转化状态、局部代谢加强、局部骨质疏松形成，极易发生软骨下骨微损伤，且微损伤的修复作用降低，关节异常负荷使软骨下骨发生形变以缓冲所增加的应力，同时亦导致骨小梁微细骨折。反复微损伤启动骨重塑过程加快，最终导致的软骨下骨增厚和密度增高，软骨下骨质变硬，使软骨和软骨下骨硬度差增大，此时局部外力作用异常会使关节软骨所受的应力作用变大，导致关节软骨退变[14]。因此，调节关节软骨下骨的代谢速度，改善软骨下骨的病变，应纳为治疗骨性关节炎的重要目标，并可能成为治疗骨性关节炎的新的途径。

本实验结果显示，模型组兔膝关节软骨下骨中BMP-2蛋白表达含量明显降低，成为早期骨性关节炎软骨下骨生成能力下降的原因，软骨下骨新骨生成能力下降导致早期骨性关节炎软骨下骨的局限性骨质疏松，增大了关节软骨的负荷应力，从而加重了关节软骨的退变。各治疗组经过治疗后，都在提高关节软骨下骨BMP-2蛋白表达起到了一定的作用，其中临床常用的玻璃酸钠对关节软骨下骨BMP-2生成能力虽有一定的提高，但低于传统中药组和中药贴膜组，表明我们所采用的中药组方在促进软骨下骨新骨生成能力优于玻璃酸钠。中药贴膜组促进BMP-2能力较传统中药组强，证实应用提取的中药成分制备成贴膜后，可以对骨性关节炎软骨下骨退变干预作用起到更好的效果。因此，中药贴膜在早期骨性关节炎治疗过程中，对提高关节软骨下骨BMP-2表达起到良好的干预作用，在避免早期骨性关节炎关节软骨下骨退变起到积极作用，继而从另一方面达到对关节软骨的保护作用。