基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在结核分枝杆菌耐药检测中的应用价值研究

余艳芳，赵开顺，屠春林，陈娓，梁海鹰，易清清，梁凯轶，孙亚蒙

结核病已成为严重危害全球范围内人群健康的公共卫生问题之一，近年来广泛耐药结核病（extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）和耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）使结核病的临床治疗困难重重。为了避免结核分枝杆菌发生获得性耐药，WHO建议结核病及疑似结核病患者在行标准抗结核治疗前进行药敏试验［1］，以早期发现耐药结核病（drug-resistant tuberculosis，DRTB）。但传统细菌耐药检测手段如表型药物敏感性试验（drug susceptibility test，DST）耗时较长（一般需要3～4周），同时因细菌生长不良或受其他微生物污染影响而导致结果不确定，进而延误患者治疗［2］。

近年随着结核分枝杆菌耐药分子机制的阐明，采用分子生物学技术检测结核分枝杆菌的耐药基因已成为诊断DR-TB的方法［3］。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF）是美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的痕量核酸检测系统，其具有检测时间快、准确度高、成本低等特点［4］。近年随着GridION（Oxofrd Nanopore Technologies）测序平台不断更新，利用纳米孔测序仪获得较大测序深度后得到的校正序列与Sanger测序相比准确率高达100%，且其鉴定微生物及微生物耐药性的费用与Illumina二代测序相当，但测序时间极大缩短了［5-6］。本研究以最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）法为药敏试验的“金标准”，以三代测序验证突变基因，旨在分析MALDI-TOF在结核分枝杆菌耐药检测中的应用价值，以期为DR-TB防控方案的制定提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2016—2020年上海市嘉定区中心医院肺科诊治的200例复治肺结核患者的痰液标本，其中男性157例，女性43例；年龄24～65岁，平均（45.0±10.3）岁。

1.2 主要试剂和材料 iPLEX Pro高保真基因型分析试剂盒购自Agena Bioscience公司（美国，10160），三代测序Barcode试剂盒购自Oxford Nanopore Technologies（英国，EXP-NBD104、EXP-NBD114），三代测序建库试剂盒购自Oxford Nanopore Technologies（英国，SQK_LSK109），测序芯片R 9.4.1购自Oxford Nanopore Technologies（英国，FLOMIN106），Invitrogen Platinum ⅡTaq热启动DNA聚合酶（美国，14966001），芯片清洗试剂盒购自Oxford Nanopore Technologies（ 英 国，SQK-RBK004）， 细 菌 DNA/RNA提取试剂盒购自宁波市重鼎生物技术有限公司（中国，ZDTG-91-100），AMPure XP Beads购自 Beckman Coulter。

1.3 检测方法

1.3.1 MIC法 采用BACTEC MGIT960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪快速培养痰液标本，鉴定为阳性的结核分枝杆菌采用MIC法进行药敏试验［7］。使用细菌DNA/RNA提取试剂盒提取结核分枝杆菌DNA样本，严格按照试剂盒说明书步骤进行操作。以MIC法为本次药敏试验的“金标准”，评价MALDI-TOF对结核分枝杆菌耐药性的检出情况。

1.3.2 MALDI-TOF 采用MALDI-TOF检测结核分枝杆菌耐药情况及耐药相关位点突变结果，具体如下：DNA模板经多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增后，采用虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）去除残留的脱氧核糖核苷三磷酸，再采用双脱氧核苷三磷酸、与待测位点的前模板匹配的特异性单碱基延伸引物进行待测位点单个碱基的延伸反应，根据延伸产物分子质量特异性区分待测位点的碱基类型。抗结核药物及其对应的基因耐药位点参考文献［8-12］，见表1。引物和单碱基延伸引物的设计及MALDI-TOF具体操作过程参照TSUCHIDA等［13］研究。

1.3.3 三代测序 采用三代测序验证MALDI-TOF检测结核分枝杆菌耐药相关位点突变的准确性，具体如下：从200份结核分枝杆菌DNA标本中随机选取20份，其对应的MIC结果见表2，分别针对表1中基因的突变热点区域设计引物，进行多重PCR扩增，产物长度约为500 bp，三代测序多重PCR的引物序列见表3。使用三代测序建库试剂盒建库上机，上机操作流程参照MORRISON等［14］的方法。具体操作步骤如下：将20份结核分枝杆菌DNA的多重PCR产物稀释至终浓度为100～200 fmol的48 μl无核酶水中，采用NEB末端修复和加T/A尾试剂盒进行末端修复，采用AMPure XP Beads磁珠纯化修复产物，将产物稀释至终浓度为100～200 fmol的22.5 μl无核酶水中，分别连接标签序列（EXP-NBD104 and EXP-NBD114 kits，ONT）。磁珠纯化上述产物并采用Qubit 3.0荧光定量仪进行定量分析，使用SQK-LSK109连接建库试剂盒（ONT官方试剂）进行混合样本建库，混合样本终浓度为100～200 fmol/L，样本终体积为65 μl。连接建库产物并采用磁珠纯化后洗脱在15 μl体系中，终浓度需为50～100 fmol/L，取12 μl 混合SQB和LB后，点样到测序芯片R 9.4.1，使用GridION×5测序3 h，下机后提取FastQ数据进行后续分析。测序完成后，清洗芯片（EXP-WSH003，ONT）并质检，当活性孔≥800时，可以用于下一次测序，将芯片按要求保存于4 ℃冰箱中。碱基识别软件为Guppy 4.5.2，数据质控软件为NanoPlot，单碱基变异（single nucleotide variant，SNV）位点识别使用Medaka。

表1 抗结核药物及其对应的基因耐药位点Table 1 Anti-tuberculosis drugs and their corresponding gene resistance sites

表2 20株结核分枝杆菌对应的MIC结果（μg/ml）Table 2 MIC results corresponding to 20 strains of Mycobacterium tuberculosis

表3 三代测序多重PCR的引物序列Table 3 Primer sequence of third generation sequencing multiplex PCR

（续表1）

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理。计数资料以相对数表示；以MIC法为药敏试验的“金标准”，计算MALDI-TOF检测结核分枝杆菌耐药的灵敏度、特异度及正确率；采用Kappa检验进行一致性分析，以Kappa值＜0.40为一致性较差，Kappa值为0.40～0.75为一致性中等，Kappa值＞0.75为一致性较高。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MALDI-TOF检测结核分枝杆菌的耐药情况 以MIC法为药敏试验的“金标准”，MALDI-TOF检测结核分枝杆菌对利福平耐药的灵敏度为93.1%、特异度为87.8%、正确率为90.5%、Kappa值为0.810；MALDI-TOF检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药的灵敏度为77.2%、特异度为98.6%、正确率为85.0%、Kappa值为0.701；MALDI-TOF检测结核分枝杆菌对左氧氟沙星耐药的灵敏度为77.8%、特异度为99.0%、正确率为88.5%、Kappa值为0.769；MALDI-TOF检测结核分枝杆菌对莫西沙星耐药的灵敏度为85.7%、特异度为76.2%、正确率为78.5%、Kappa值为0.516；MALDI-TOF检测结核分枝杆菌对阿米卡星耐药的灵敏度为94.9%、特异度为89.4%、正确率为90.5%、Kappa值为0.736；MALDI-TOF检测结核分枝杆菌对卷曲霉素耐药的灵敏度为88.9%、特异度为87.8%、正确率为88.0%、Kappa值为0.654，见表4。

表4 MALDI-TOF检测结核分枝杆菌对抗菌药物耐药的效能（株）Table 4 Efficacy of MALDI-TOF in detecting antimicrobial resistance of Mycobacterium tuberculosis

2.2 三代测序验证MALDI-TOF检测结核分枝杆菌耐药相关位点突变的准确性 三代测序时间为3 h，获得518.8 M数据（其中碱基质量值＜9的数据有88.79 M），测序质量通过读长N50=530，平均测序质量为12.7，见表5。下机数据的fast5文件转换为fastq文件（guppy_basecaller -i fast5_pass-s fast5_pass --config dna_r9.4.1_450bps_hac.cfg -r --num_callers 4 --cpu_threads_per_caller 4 --fast5_out）（Guppy Version 4.5.2），数据质控（guppy_basecaller -i fast5_pass -s fast5_pass --config dna_r9.4.1_450bps_hac.cfg -r --num_callers 4 --cpu_threads_per_caller 4 --fast5_out），拆分20个样本的barcode（guppy_barcoder guppy_barcoder -i sample_fastq -s .--barcode_kits "EXP-NBD104 EXP-NBD114" --allow_inferior_barcodes），去除各样本barcode序列（guppy_barcoder --input_path sample_fastq --save_path . --config configuration.cfg --trim_barcodes），以结核分枝杆菌H37Rv的序列为参考基因组，识别各样本的SNV位点（medaka_haploid_variant -i sample.fastq-r ref.fna -t 16 -m r941_min_high_g360）。在20份分枝结核杆菌中，MALDI-TOF检测的耐药突变位点与三代测序检测的耐药突变位点一致率为100%；此外，三代测序还获得MALDITOF检测体系中未涉及的突变位点，见表6～7。

表5 基于NanoPlot的数据质控结果Table 5 Data quality control results based on NanoPlot

表6 MALDI-TOF检测的耐药相关位点突变结果Table 6 Mutation results of drug resistance related sites detected by MALDI-TOF

3 讨论

中国是结核病高负担国家，近年来结核分枝杆菌原发耐药率和继发耐药率不断上升，复治患者耐药率相对较高，究其原因主要为疾病初期未采取合理的治疗方案、抗生素滥用、服药不规律和患者依从性差等［15］。近年随着分子生物学技术进步，临床上可快速、敏感地检测出结核分枝杆菌耐药菌株，进而为临床治疗方案的制定提供实验依据，也为结核病的控制提供了理论基础［2］。

表7 三代测序检测的耐药相关位点突变结果Table 7 Mutation results of drug resistance related sites detected by thirdgeneration sequencing

既往研究表明，95%以上的利福平耐药菌株突变发生在rpoB基因81bp（密码子507-533）的耐药决定区，密码子531位点是最常见的突变位点［16］，但rpoB基因突变与利福平耐药的关系存在地域性差异［17］。有研究发现，异烟肼耐药主要与KatG、inhA 基因突变相关［18］，KatG基因密码子315是引起异烟肼耐药的主要突变位点（76.9%）［19］；但也有研究结果显示，KatG基因密码子315的突变频率很低［20］。在全球范围内，结核分枝杆菌对异烟肼耐药、对利福平敏感是最常见的耐药模式，而采用标准抗结核治疗模式会导致治疗失败或MDT-TB患者数量增加，甚至转变为XDR-TB，因此快速、准确地检测结核分枝杆菌耐药情况十分重要［21-23］。

根据WHO的建议，治疗MDR-TB患者时应首先进行氟喹诺酮类和二线注射类药物的药敏试验或分子药敏试验，然后再确认治疗方案，以减少XDR-TB的产生［1］。gyrA基因、gyrB基因、rrs基因和eis基因分别是氟喹诺酮类和二线注射类药物分子耐药的主要机制，可以解释60%～90%的耐药情况［24-26］。本研究结果显示，MALDI-TOF与MIC法检测结核分枝杆菌对莫西沙星耐药的Kappa值为0.516，分析MIC结果和三代测序数据发现，20例标本均显示对氟喹诺酮类药物耐药，同时三代测序结果还显示，gyrA基因61密码子和284密码子均突变。但也有研究证实，gyrA基因284密码子的突变与氟喹诺酮类药物的耐药无关［27］，故gyrA基因61密码子突变与氟喹诺酮类药物耐药的关系值得进一步研究。此外，本研究结果还显示，20份结核分枝杆菌中7号菌株gyrB基因1510位点是G→A的突变，该位点是MALDI-TOF未检测出的突变位点，该标本临床药敏试验结果显示对氟喹诺酮类耐药，需持续关注。

综上所述，通过MALDI-TOF检测的结核分枝杆菌对常用抗结核药物耐药结果与MIC法高度或中度一致，其检测的耐药突变位点与三代测序检测的耐药突变位点一致率为100%，故MALDI-TOF检测的结核分枝杆菌耐药结果可以作为临床鉴定结核分枝杆菌药敏试验结果的有效补充。

作者贡献：余艳芳、屠春林进行文章的构思与设计；余艳芳、孙亚蒙进行研究的实施与可行性分析；余艳芳、赵开顺、陈娓、梁海鹰进行数据收集、整理、分析；易清清、梁凯轶进行结果分析与解释；余艳芳负责撰写、修订论文；屠春林负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。