柴胡软坚消瘿颗粒对肝郁脾虚型桥本甲状腺炎大鼠Th1/Th2及Th17/Treg平衡的影响

2021-11-07 11:05许可张碧辰商雪纯张兰
环球中医药 2021年10期
关键词:金水柴胡颗粒

许可 张碧辰 商雪纯 张兰

桥本甲状腺炎(hashimoto’s thyroiditis,HT)又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎,是临床上常见的导致甲状腺功能减退的主要原因之一[1]。随着社会发展和人们生活、工作压力的增加,甲状腺疾病发病率逐年升高,威胁人们健康[2]。HT在中医统属于“瘿病”,情志失调、肝郁脾虚均与HT的发病有关[3]。HT是一种特异性自身免疫性甲状腺疾病,CD4+T细胞可分化为辅助性T细胞1(helper T cell 1,Th1)、辅助性T细胞2(helper T cell 2,Th2)、辅助性T细胞17(helper T cell 17,Th17)、调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)细胞亚型,参与炎症反应、细胞免疫、体液免疫应答、免疫调节,并维持机体免疫平衡,研究表明Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡与HT等多种自身免疫性疾病的发生有关[4- 5]。逍遥散具有疏肝健脾、软坚散瘿的功效,临床上能够降低HT患者炎症因子水平,改善患者症状[6]。本研究通过构建肝郁脾虚型HT大鼠模型,探讨柴胡软坚消瘿颗粒对肝郁脾虚型HT大鼠治疗的效果及可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体级Sprague Dawley雌性大鼠(182~214 g),选购于辽宁长生生物科技有限公司,许可证号码:SCXK(辽)2015-0001,饲养于辽宁中医药大学动物实验中心,常规喂养,适应性饲养1周。研究经本院动物伦理道德委员会批准。

1.2 实验药物

柴胡软坚消瘿颗粒剂:当归10 g、白芍15 g、柴胡6 g、茯苓10 g、太子参15 g、白术6 g、海藻8 g、昆布8 g、酒萸肉10 g、山药10 g、熟地黄20 g、陈皮8 g、清半夏6 g、香橼6 g、佛手6 g,江阴天江药业有限公司生产的中药颗粒剂;金水宝片(产品批号:201112)江西济民可信药业有限公司。

1.3 试剂与仪器

完全弗氏佐剂,不完全弗氏佐剂,猪甲状腺球蛋白,无水碘化钠,美国西格玛公司(货号分别为:F5506、F5881、A9011、7681-82-5);甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody,TGAb)、甲状腺过氧化酶抗体(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)、游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine,FT4)、促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)酶联免疫吸附试剂盒,购于上海信帆生物科技有限公司(货号分别为:XFR30792、XFFM248D、XFR31488、XF433、XFR30548);γ-干扰素(γ-interferon,IFN-γ)、白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)、白细胞介素17(interleukin 17,IL-17)、白细胞介素35(interleukin 35,IL-35)酶联免疫吸附试剂盒,武汉纯度生物科技有限公司(货号分别为:CD-2570ELAS、CD-117786-ELISA、CD-117814-ELISA、CD-2270ELA);红细胞裂解液,苏木素—伊红染色试剂盒,北京索莱宝生物科技有限公司(货号为:R1010、G1120-100);CD3-藻红蛋白-Cy5(phycoerythrin-Cy5,PCy5)、CD8-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)、IFN-γ-FITC、IL-4-藻红蛋白(P-phycoerythrin,PE)、IL-17-PE、CD4-FITC、CD25-别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)、转录因子叉头盒蛋白P3(forkhead box protein p3,Foxp3)-PE抗体,美国Biolegend公司(货号分别为: cat 2558、F7250-50MG、102373、5889-1、25-7177-80、305206、DXT-130-109-052、GOY-(elisa)-18307);兔抗鼠T盒子转录因子(T-box transcription factor,T-bet)、GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)、Foxp3、维A酸相关孤独受体γt(retinoid related orphan receptor γt,RORγt)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗、山羊抗兔IgG H&L,艾博抗(上海)贸易有限公司(货号分别为:ab109253、150309、ab2481、SND-M176、9001-50-7、SY0674);组织裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白提取试剂盒,上海碧云天生物科技有限公司(批号为:P0013B、20112548)。

FACSCanto II流式细胞仪,美国Becton Dickinson公司;ELX808酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;BX41 荧光显微镜,日本奥林巴斯公司;EG1150包埋机,LEICSRM2235石蜡切片机,德国莱卡公司;蛋白凝胶成像系统,美国Ultra-Violet Products公司。

1.4 大鼠模型构建

随机数字表法将48只大鼠分为正常组(12只)和造模组(36只)。适应性饲养1周后,于第2周给予大鼠500 mg/L高浓度碘水喂养,第4周的第1天和第4天,于大鼠背部皮下多点注射100 μg/次猪甲状腺球蛋白(经完全弗氏佐剂完全乳化)。第5~8周,每周进行一次加强免疫诱导,注射方法剂量同初次免疫一致。实验第5周开始,将大鼠每半日限制于束缚筒内3小时,剩余半日强制大鼠游泳至体力耗竭,足量饲料与禁食饲料隔日交替喂养,连续4周。正常组大鼠给予蒸馏水,常规喂养[7]。

实验第9周,所有大鼠眼球后静脉丛穿刺术取血2 mL,4℃,3000 r/min离心15分钟,收集血清,检测大鼠血清TGAb、TPOAb水平,模型组大鼠血清TGAb和TPOAb抗体水平超正常组大鼠抗体水平的2倍及以上,代表造模成功[7],实验过程中,有2只大鼠造模失败,1只大鼠死亡,33只大鼠造模成功。

记录实验前后大鼠体重、日摄食量;于试验前后分别收集大鼠日排粪便,计算大鼠粪便含水量。

旷场实验分析大鼠行为,大鼠逐只放置于旷场箱中,安静状态下,大鼠缓慢放于矿场箱底部中心,计时观察5分钟;记录大鼠于旷场箱中抬头、站立、修饰次数及穿格数量。

1.5 动物分组与给药

随机将33只造模成功的大鼠随机分为模型组、金水宝片组和柴胡软坚消瘿颗粒组,每组11只。柴胡软坚消瘿颗粒加至烧开蒸馏水中,混匀制成柴胡软坚消瘿颗粒药液,配比为11.43 g/10 mL;金水宝片研磨成细粉,加至烧开蒸馏水中,制成混悬液,配比为0.45 g/10 mL。参照《药理实验方法学》[8],根据每周大鼠体质量变化换算大鼠有效给药量,正常组和模型组,每次给予2 mL蒸馏水灌胃;金水宝片组,按照0.45 g/(kg·d)剂量给药,分2次灌胃;柴胡软坚消瘿颗粒组,按11.43 g/(kg·d)给药,分2次灌胃,疗程共8周。实验过程中,观察大鼠一般形态。

1.6 流式细胞术检测大鼠外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞

末次给药12小时后,所有大鼠腹主动脉取血2 mL,分装2管,一管置于-80℃冰箱,用于后续实验。取100 μL大鼠外周血,肝素钠抗凝,红细胞裂解液裂解细胞,离心收集细胞,加CD3、CD8、IFN-γ、IL-4、IL-17抗体,检测Th1、Th2、Th17细胞;加CD4、CD25、Foxp3抗体检测Treg细胞。

1.7 酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清甲状腺抗体、甲状腺功能指标及相关细胞因子水平

取1.6中保存于-80℃冰箱大鼠外周血,4℃,3000 r/min离心15分钟,收集上清。酶联免疫吸附试剂盒检测大鼠血清中TPOAb、TGAb、FT3、FT4、TSH及IFN-γ、IL-10、IL-17、IL-35等水平,实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.8 苏木素—伊红染色法检测各组大鼠甲状腺组织形态

取血结束后,脊椎脱臼法处死大鼠,大鼠头颈部血管处取出甲状腺,分为2份,一份置于10%福尔马林中固定,酒精梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。另一部分存于-80℃冰箱,用于后续实验研究。

石蜡切片进行4 μm连续切片,脱蜡至水,进行苏木素—伊红染色,透明,封片,显微镜下观察大鼠甲状腺组织形态。

1.9 蛋白免疫印迹法检测各组大鼠甲状腺组织T-bet、GATA3、Foxp3、RORγt的蛋白表达

取1.8中存于-80℃冰箱的甲状腺组织,加入组织裂解液,研磨,匀浆,4℃离心,收集上清。BCA试剂盒检测蛋白浓度,之后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳结束后,转膜,5%脱脂奶粉封闭,加入兔抗鼠T-bet、GATA3、Foxp3、RORγt、GAPDH,4℃孵育过夜,TBST洗膜,加入山羊抗兔IgG,37℃孵育,TBST洗膜,蛋白凝胶成像仪成像,ImageJ软件分析蛋白T-bet、GATA3、Foxp3、RORγt的表达。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般形态

正常组大鼠皮毛顺滑光洁,日常活动度较好,精神状况佳,饮食正常规律,排便形状未见异常。造模组大鼠进行联合诱导前期挣扎激烈,于束缚桶内抵抗撕咬反应明显,出桶后抵抗明显,呈对峙状态。造模后期大鼠挣扎反应明显减弱,精神状态低下,活动度降低,皮毛枯黄质脆,饮食不佳,排便偏稀。金水宝片及柴胡软坚消瘿颗粒治疗后,大鼠上述症状明显改善。

造模前,正常组和造模组大鼠体重、摄食量、粪便含水率比较差异无统计学意义。造模后,与正常组相比,造模组大鼠体重、摄食量、粪便含水率显著降低,旷场实验运动5分钟距离、中央穿格次数显著减少,而中央停留时间增加(P<0.01)。见表1。

表1 造模后正常组与模型组大鼠体重、摄食量、粪便含水率及旷场实验结果比较

2.2 柴胡软坚消瘿颗粒对大鼠甲状腺自身抗体滴度及甲状腺功能指标的影响

与正常组相比,模型组大鼠血清TPOAb、TGAb、FT3、FT4水平显著升高,TSH水平显著降低(P<0.01);与模型组相比,金水宝片组、柴胡软坚消瘿颗粒组大鼠血清TPOAb、TGAb水平FT3、FT4水平显著降低,TSH水平显著升高(P<0.01);与金水宝片组相比,柴胡软坚消瘿颗粒组大鼠血清TPOAb、TGAb水平FT3、FT4水平显著降低(P<0.01),TSH水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠甲状腺自身抗体滴度及甲状腺功能指标比较

2.3 柴胡软坚消瘿颗粒对大鼠甲状腺组织形态学的影响

正常组甲状腺结构完整,滤泡腔及上皮细胞构型规则、形态趋近,无炎性浸润;模型组甲状腺构型不完整,滤泡结构破坏,形态不规整,腔内胶质成分减少,存在大量炎性浸润;与模型组相比,金水宝片组、柴胡软坚消瘿颗粒组甲状腺结构相对完整,组织破坏不明显,滤泡形态改变相对不明显,滤泡腔内外细胞核相对减少,存在少量炎性浸润,见图1。

注:A.正常组;B.模型组;C.金水宝片组;D.柴胡软坚消瘿颗粒组

2.4 柴胡软坚消瘿颗粒对大鼠血清Th1/Th2及Th17/Treg平衡的影响

与正常组相比,模型组大鼠Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg、IFN-γ、IL-17水平显著升高,Th2、Treg、IL-10、IL-35水平显著降低(P<0.01);与模型组相比,金水宝片组、柴胡软坚消瘿颗粒组大鼠Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg、IFN-γ、IL-17水平显著降低,Th2、Treg、IL-10、IL-35水平显著升高(P<0.01);与金水宝片组相比,除Treg外,柴胡软坚消瘿颗粒组大鼠血清Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg、IFN-γ、IL-17水平显著降低,Th2、IL-10、IL-35水平显著升高(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠血清Th1/Th2、Th17/Treg及相关细胞因子比较

2.5 柴胡软坚消瘿颗粒对大鼠甲状腺组织T-bet、GATA3、Foxp3、RORγt蛋白表达的影响

与正常组相比,模型组大鼠GATA3、Foxp3表达显著降低,T-bet、RORγt显著升高(P<0.01);与模型组相比,金水宝片组、柴胡软坚消瘿颗粒组大鼠GATA3、Foxp3表达显著升高,T-bet、RORγt表达显著降低(P<0.01);与金水宝片组比较,柴胡软坚消瘿颗粒组大鼠GATA3、Foxp3表达显著升高,T-bet、RORγt表达显著降低(P<0.01)。见表4、图2。

表4 各组大鼠甲状腺组织T-bet、GATA3、Foxp3、RORγt的蛋白表达比较

注:A:正常组;B:模型组;C:金水宝片组;D:柴胡软坚消瘿颗粒组

3 讨论

HT是一种以识别自身组织为抗原信号的自身免疫性疾病,临床表现为血清中TPOAb和TGAb滴度超过正常滴度的2倍,甲状腺组织出现淋巴浸润及纤维增生的病理改变[9]。柴胡软坚消瘿颗粒为化裁经典解郁名方逍遥散意加减而来,兼具有舒肝健脾及软坚消瘿之功效。君药为柴胡,具有疏肝解郁,调达肝气之功效,对本病可起到调畅气机、改善情绪郁结的作用;白芍,敛阴养血,止痉柔肝;当归,养血活血,二者合用可避免应用方中柴胡造成宣泄太过,可起到调和共济的作用;香橼、佛手可起到疏肝理气和中之效;茯苓、山药、太子参和白术具有健脾益气补中等疗效;酒萸肉和熟地黄可起到填髓充精的固本之效;陈皮和半夏针对本病发挥祛痰燥湿、软坚散结的作用;海藻及昆布皆为含碘中药,可以共用来祛痰消瘿、利水散结,调和组方。本方具有针对性的软坚消瘿、舒肝健脾之功效,兼可促进患者免疫功能的恢复,从而祛病除邪,达到扶正补元的根治作用。临床应用观察显示其具有明显降低甲状腺自身双抗体滴度水平及改善患者各种不适症状的功效[2]。本研究基于中医辨证施治理论,通过构建肝郁脾虚HT大鼠模型,模拟临床上HT发病过程,发现造模组大鼠早期易激惹,后期活动度减退,食少便溏,血清甲状腺抗体TGAb、TPOAb滴度显著升高,甲状腺组织损伤严重,甲状腺功能亢进,且呈现肝郁脾虚状态,经柴胡软坚消瘿颗粒治疗后,模型组大鼠血清TGAb、TPOAb滴度显著降低,甲状腺组织损伤减轻,甲状腺功能得到明显改善,且效果略好于金水宝片,提示柴胡软坚消瘿颗粒对治疗肝郁脾虚型HT大鼠效果显著。

Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡在机体免疫中具有重要作用,未分化的CD4+T细胞在受到IL-12、IFN-γ等炎症因子刺激后,分化出Th1、Th2、Th17、Treg等不同Th细胞亚型,维持免疫功能稳态,Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡则会导致免疫功能失调,从而引起自身免疫性疾病的发生[10]。Th1细胞,亦被称之为炎症性T细胞,研究表明Th1通过分泌IFN-γ、IL-2等炎症因子,使淋巴细胞浸润甲状腺腺体,引起甲状腺组织破坏和细胞凋亡[11]。Th2细胞介导体液免疫,通过分泌IL-4、IL-10等细胞因子对Th1进行功能拮抗,抑制Th1细胞活化与增殖[12]。Th17细胞主要分泌IL-17、IL-23等促炎因子,诱导多种促炎细胞因子和趋化因子的分泌,参与机体炎症和免疫防御[13]。Treg细胞是一种具有免疫抑制作用的CD4+T细胞,通过分泌IL-10、IL-35等抑炎性细胞因子,抑制CD4+T、CD8+T等细胞的活化和增殖,发挥免疫抑制作用[14]。Safdari等[10]研究表明HT患者血清Th1、Th17水平显著高于正常对照组,而Th2、Treg水平显著降低,患者存在Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡。本研究发现模型组大鼠存在Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡,Th1、Th17功能亢进,二者细胞因子IFN-γ、IL-17水平显著升高,高于正常组,而Th2、Treg细胞因子IL-10、IL-35水平显著降低,提示Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡可能与肝郁脾虚HT的发生有关,猜测可能是Th1、Th17细胞的增多导致Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡向Th1和Th17方向偏移,引起机体免疫失衡和炎症反应增强,导致甲状腺组织损伤,从而促进HT的发生。进一步研究发现,柴胡软坚消瘿颗粒组大鼠Th1、Th17细胞及IFN-γ、IL-17水平减少,而Th2、Treg细胞和IL-10、IL-35水平增加,提示柴胡软坚消瘿颗粒可改善HT大鼠Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡。

T-bet、GATA3是人体重要的转录调节因子,T-bet属于转录因子T-box家族,是Th1细胞的特异性转录因子,能够诱导CD4+T细胞产生IFN-γ,促进CD4+T细胞向Th1分化[15]。GATA3是一种锌指结构转录因子,通过调控IL-4等Th2相关因子的表达,促进CD4+T细胞向Th2分化[16]。GATA3能够抑制T-bet的转录,抑制IFN-γ的表达,进而抑制CD4+T细胞向Th1方向转化[17]。RORγt是调节Th17分化的特异性转录因子,是Th17的特异性标志物,Foxp3是Treg细胞发育和功能维持的关键转录因子,是Treg细胞的标志物[18]。Foxp3是调节Treg细胞功能维持的关键转录因子,能够抑制RORγt的表达,从而抑制Th17细胞的分化[19]。本研究发现模型组大鼠甲状腺组织T-bet、RORγt蛋白表达显著升高,GATA3、Foxp3表达显著降低,柴胡软坚消瘿颗粒治疗能够提高GATA3、Foxp3蛋白的表达,提示柴胡软坚消瘿颗粒可能通过促进蛋白GATA3、Foxp3的表达,促进Th2、Treg细胞的分化,抑制Th1、Th17细胞的增殖,调节Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡,可能是柴胡软坚消瘿颗粒治疗HT的机制。

综上所述,柴胡软坚消瘿颗粒对肝郁脾虚HT大鼠治疗有一定的疗效,可能与调节Th1/Th2及Th17/Treg细胞平衡有关。然而本研究仅从大鼠实验水平探讨了柴胡软坚消瘿颗粒在治疗肝郁脾虚HT中的可能机制,下一步需结合临床实验进一步探讨相关机制。

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