内蒙古地区纹带棒杆菌临床分离株的耐药性及协同溶血活性

王艳艳张健吕莹莹刘柔杉王颖君朝鲁门其其格王俊瑞

1内蒙古医科大学附属医院检验科，呼和浩特010050；2巴彦淖尔市人民医院检验科，内蒙古巴彦淖尔015000；3内蒙古医科大学附属医院儿科，呼和浩特010050

纹带棒杆菌为无芽孢革兰阳性杆菌，广泛分布于自然界环境中，是定植于人体黏膜和皮肤表面的一类正常菌群[1]。近年，随着抗菌药物、激素和免疫抑制剂的广泛使用以及侵入性医疗操作的增多，纹带棒杆菌逐渐成为一种重要的条件致病菌[2-4]，可引起肺部、血流和神经系统等多部位感染，且多为重症感染，甚至危及生命[5-6]。目前，针对纹带棒杆菌的研究主要集中在耐药性、耐药机制以及医院感染特征等方面[4，7-10]，但关于纹带棒杆菌协同溶血作用及其临床意义的报道少见。本研究对2013—2020年内蒙古地区500株纹带棒杆菌临床分离株的耐药特征及协同溶血活性进行初步分析，为进一步了解纹带棒杆菌的临床意义及致病性提供参考依据。

材料与方法

一、菌株来源

收集2013年11月至2020年5月间内蒙古医科大学附属医院和内蒙古巴彦淖尔市人民医院住院患者的500株纹带棒杆菌。样本来源包括痰液、支气管肺泡灌洗液、全血、伤口分泌物、尿液、脓液、胸腹水、鼻咽拭子、引流液和导管等。所有患者均对本次研究知情同意。本研究所有菌株均分离自常规临床送检样本，属于免伦理审查范围（免伦理审查批文号：KY2020029）。

二、仪器与试剂

细菌鉴定采用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定系统（法国生物梅里埃公司）及microTyper MALDI-TOF质谱仪（江苏天瑞仪器有限公司厦门分公司）进行鉴定和复核。生化鉴定卡为VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定系统配套的厌氧菌-棒状杆菌鉴定卡（ANC卡）。血琼脂平板购自天津金章有限公司。

三、体外药敏试验

根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的抗菌药物敏感性试验执行标准[11]，采用微量肉汤稀释法进行药敏试验。棒状杆菌药敏板由天津金章有限公司定做，肉汤中添加2.5%～5%溶解马血。依据文献[10]选择实验用的11种抗菌药物，浓度设置如下：万古霉素（0.5~4 μg/mL）、亚胺培南（1~32 μg/mL）、克林霉素（1~16 μg/mL）、利奈唑胺（0.5~4 μg/mL）、头孢吡肟（1~16 μg/mL）、四环素（1~16 μg/mL）、复方磺胺甲 唑（0.5/9.5~8/152 μg/mL）、庆大霉素（1~16 μg/mL）、环丙沙星（1~32 μg/mL）、红霉素（0.5~8 μg/mL）和青霉素（1~16 μg/mL）。质控菌株为肺炎链球菌ATCC 49619。耐药谱分型依据菌株对不同抗菌药物的敏感性和差异进行统计分析。

四、协同溶血试验

参照《临床微生物检验标准化操作》[12]规范进行协同溶血试验操作，标准菌株选用金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）和铜绿假单胞菌（ATCC 27853）。实验基本流程如下：先用金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）或铜绿假单胞菌（ATCC 27853）在血琼脂平板上划一横线，再取待检菌株纯培养物与前一划线做垂直划线接种，两者相距0.5~1.0 cm。置35℃孵箱培养24~48 h，观察结果。

五、统计学分析

采用描述性流行病学方法分析纹带棒杆菌分布及耐药情况，计数资料采用株数和率表示。

结 果

一、菌株分布

500株纹带棒杆菌中，451株分离自合格痰液样本（90.2%），19株分离自伤口分泌物样本（3.8%），6株分离自支气管肺泡灌洗液样本（1.2%），5株分离自尿液样本（1.0%），4株分离自全血样本（0.8%），4株分离自鼻咽拭子（0.8%），引流液、胸腹水、脓肿穿刺液样本各分离3株（0.6%），2株分离自导管样本（0.4%）。

500株纹带棒杆菌分离株涉及23个不同科室，其中以重症监护病房检出率最高（156株，31.2%），其次为神经外科（119株，23.8%）和呼吸科（68株，13.6%），其他依次为神经内科（28株，5.6%）、骨科（22株，4.4%）、普外科（21株，4.2%）、康复科（19株，3.8%）等。分离出纹带棒杆菌的患者年龄范围为5月龄~90岁，以≥60岁者（318例，63.6%）居多，且多数伴有严重的基础疾病、接受手术治疗或有创诊疗操作。

二、其他病原菌检出情况

500株纹带棒杆菌分离株中，216株（43.2%）同时分离出纹带棒杆菌和其他病原菌，包括鲍曼不动杆菌74株（14.8%）、铜绿假单胞菌42株（8.4%）、金黄色葡萄球菌39株（7.8%）、肺炎克雷伯菌32株（6.4%）、大肠埃希菌20株（4.0%）、嗜麦芽窄食单胞菌20株（4.0%）和阴沟肠杆菌10株（2.0%）；其中7株（1.4%）同时分离出鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌，7株（1.4%）同时分离出铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。

三、体外药敏试验结果

500株纹带棒杆菌分离株对青霉素、环丙沙星、头孢吡肟、复方磺胺甲 唑、红霉素、亚胺培南和克林霉素等7种药物的耐药率均≥90.0%，且最低抑菌浓度（MIC）也较高（MIC90值为32～≥64 μg/mL），其中环丙沙星耐药率最高达到99.2%；亚胺培南耐药率为90.8%，MIC90值均≥64 μg/mL；对庆大霉素耐药率为41.8%，中介率高达20.6%，MIC90值≥32μg/mL；对万古霉素和利奈唑胺耐药率均为0，MIC90值均为1 μg/mL，暂无耐药株出现，具体结果见表1。

表1 内蒙古地区纹带棒杆菌临床分离株对抗菌药物耐药性分析（n=500）

进一步对500株菌株的耐药谱分型，500株纹带棒杆菌划分为19个耐药表型，优势耐药克隆株为R1和R2型，其中R1型占比39.6%，该型菌株对除万古霉素和利奈唑胺之外其余9种抗菌药物全部不敏感（大多数为耐药，少部分为中介）；R2型占比32.2%，表现为对除万古霉素、利奈唑胺和庆大霉素之外其余8种抗菌药物全部不敏感（大多数为耐药，少部分为中介），其它17个耐药型菌株占比仅为28.2%，具体结果见表2。对于优势耐药克隆株R1和R2型菌株，在2013—2020年间每年都有检出。

表2 内蒙古地区纹带棒杆菌临床分离株的耐药表型分析（n=500）

四、菌株耐药性变化情况

各年份分离的纹带棒杆菌菌株对四环素和庆大霉素的耐药率变化较大。2013—2019年间庆大霉素的耐药率呈上升趋势，2016年增幅最为明显，2020年耐药率明显下降，该年度庆大霉素中介菌株占比11.7%。四环素耐药率在2016年和2017年大幅降低，其他年份耐药率均在70.0%以上。青霉素、头孢吡肟、复方磺胺甲 唑、红霉素、克林霉素耐药率变化不明显，除2013年之外，其他年份耐药率均维持在较高水平（≥90.0%）。亚胺培南耐药率在2014—2020年间维持在高水平上，均在86.0%以上。

五、混合感染菌株耐药性

对73株混合感染金黄色葡萄球菌和（或）铜绿假单胞菌样本中的纹带棒杆菌菌株进行耐药性分析发现，青霉素、环丙沙星、头孢吡肟、复方磺胺甲唑、红霉素、亚胺培南和克林霉素等7种药物的耐药率均≥90.0%，庆大霉素耐药率最低为37.0%，但其中介率高达26.0%。具体结果见表3。

表3 混合感染金黄色葡萄球菌和（或）铜绿假单胞菌的纹带棒状杆菌耐药性特征（n=73）

六、协同溶血试验结果

500株纹带棒杆菌中，395株（79.0%）菌株与金黄色葡萄球菌协同溶血试验阳性（图1 A）；393株（78.6%）与铜绿假单胞菌（图1 B）和金黄色葡萄球菌协同溶血试验均为阳性，其主要分布在神经外科、ICU和呼吸内科等，这类菌株耐药表型为R1~R5型，其中99.7%菌株为多重耐药。有105株纹带棒杆菌协同溶血试验均为阴性，2株菌株仅与金黄色葡萄球菌协同溶血试验阳性。在39份同时分离到金黄色葡萄球菌和纹带棒杆菌的样本中，有36份（92.3%）样本菌株协同溶血试验阳性；在42份同时分离到铜绿假单胞菌和纹带棒杆菌的样本中，有37份（88.1%）阳性。

图1 纹带棒杆菌与金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的协同溶血试验

讨 论

多数棒状杆菌为人体黏膜或皮肤表面正常菌群，但近年来研究发现纹带棒杆菌检出率呈明显上升趋势[13-15]，有研究报道显示纹带棒杆菌具有多重耐药特征，引起了国内外医务工作者的重视[10]。此外，纹带棒杆菌可在医院环境中长期存在并可引起医院内暴发流行[16]。本研究中检出的纹带棒杆菌主要分离自下呼吸道样本，且这些样本主要分离自免疫力低下、接受抗菌治疗或伴有严重基础疾病的患者，均为纹带棒杆菌的易感人群[7，10]。

本研究显示，内蒙古地区的500株纹带棒杆菌临床分离株对11种测试抗菌药物整体耐药率较高，与国内其他学者研究结果相近[2，7]；对亚胺培南、红霉素和庆大霉素耐药率明显高于之前其他同类报道[2，7，9，11]。2013—2020年间，纹带棒杆菌对大部分抗菌药物耐药率无明显变化，但对庆大霉素的耐药率呈上升趋势，其耐药性变迁值得关注。由于菌株收集等原因，2013年和2016年实际测试菌株数较少，这2个年份所得菌株耐药率数据可能存在较大偏差。耐药谱分型结果显示，R1、R2等型别的优势菌株呈多重耐药特征。在2013—2020年间，优势菌株可在住院患者中持续检出，提示其不仅具有多重耐药特征且具有强大的医院内传播能力[7，10，17]。

溶血素作为金黄色葡萄球菌的一种重要外毒素，是造成金黄色葡萄球菌感染最重要的致病因子之一［18］。此外，研究发现铜绿假单胞菌溶菌素会协同破坏类脂和卵磷脂，同时产生细胞毒素增强其宿主侵袭能力[19]。协同溶血试验可用于筛查或初步鉴别可促进金黄色葡萄球菌或其他可产生β-溶血素的菌株，同时感染这2种病原菌的患者，金黄色葡萄球菌溶血素的溶血活性将增强，可能会出现更严重的溶血，特别是血流感染或重症感染患者。本研究发现，分别有79.0%和78.6%的纹带棒杆菌与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌具有协同溶血活性，可能会增强这两类病原菌的致病性，提示当临床样本中同时分离到纹带棒杆菌和金黄色葡萄球菌和（或）铜绿假单胞菌时，应重新评估纹带棒杆菌的临床意义及致病性。此外，本研究中发现2株纹带棒杆菌（C291和C451）对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的协同溶血活性实验结果不一致，可能与这2株纹带棒杆菌菌株所分泌的类协同溶血因子的结构及活性特征有关，有待进一步探究。

综上所述，纹带棒杆菌具有高检出率和多重耐药特征，特别是对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有协同溶血活性的分离株，应关注其感染患者可能出现的严重溶血反应，及时制定适合的治疗方案。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突