绵羊附睾头、体、尾上皮细胞的培养及相关基因表达

杜 炜，栾兆进，宋慧子，王兆琛，赵勇超，张家新

（内蒙古农业大学动物科学学院 010018）

1 实验方法

1.1 附睾上皮细胞的分离培养

将附睾头、体、尾组织分离，分别浸泡在加入PS的DPBS中使附睾组织中的精子成分上游，用眼科手术剪刀将组织剪成2～3mm小块，并剔除其中结缔组织，移入1mg/ml胶原蛋白酶Ⅳ中，37℃水浴震荡消化30min，用孔径为0.15mm不锈钢滤网将消化液过滤，用DPBS冲洗滤网上的管状组织块，RPMI-1640培养基1350r/min离心5min清洗3次取得管状组织块，每个60皿中约放置60个块，加入3mLRPMI1640培养基（含体积分数10%胎牛血清、5µg/mL转铁蛋白、100nmol/L雄激素、50U/mL青霉素和50µg/mL链霉素）37℃、5%CO2培养箱中培养，待单层细胞融合度达80%时，去掉组织块，即得原代附睾上皮细胞[1]。

1.2 附睾上皮细胞体外传代培养

待细胞融合接近80%～90%时传代，加入0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化2min，光镜下观察到细胞收缩变圆或少数脱落浮起时，加入完全培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮后，收集离心，重悬后接种到新的培养瓶[2]。

1.3 实时荧光定量PCR测定附睾头、体、尾上皮细胞相关基因

使用TBGreenTMPremixExTaqTMⅡ（Takara）对GPx5基因进行相对定量试验。反应条件如下:95℃、10min;95℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，进行40个循环反应。反应体系为20μL:TBGreenTMPremixExTaqTMⅡ（2×）10μL，cDNA2μL，上 下 游引 物 各0.8μL，ddH2O6.4μL。利用2-ΔΔct法 与β-actin进行相对定量计算[3]。

表1 P66、SERPIN1、DCXR 、AK1和Clu基因引物序列

2 实验结果

2.1 附睾头、体、尾上皮细胞的分离及传代培养

附睾上皮细胞，24h内以球状团块形式贴壁生长。36h后，细胞团逐渐变平并扩散成单层，外观呈菌落状的生长形态。原代附睾头上皮细胞、附睾体上皮细胞3d内达到融合。可以用0.25%胰蛋白酶消化传代至少8～10次（传代比率为1∶2）。相比之下，附睾尾上皮细胞培养7d才能融合。经过4～5次传代后，上皮细胞通常显示细胞体积增大，形状趋于扁平且不规则，并带有大量胞质液泡。

图1 上皮细胞培养图

2.2 附睾相关基因在附睾头、体、尾上皮细胞的表达差异

从p66mRNA、P34HmRNA、seRPINA1的基因表达量来看，附睾头、体、尾上皮细胞的基因表达量比较均存在显著差异，且头部＞体部＞尾部（P＜0.01）；从ak1mRNA来看，附睾头部上皮细胞基因表达量显著高于体部（P＜0.05）；从clumRNA看，附睾头、体部的基因表达量显著高于尾部（P＜0.01）（见图2）

图2 附睾头、体、尾上皮细胞相关基因表达差异

3 讨论与结论

从p66mRNA，附睾头、体、尾上皮细胞的基因表达量比较均存在显著差异，且头部＞体部＞尾部（P＜0.01）；考虑p66mRNA的基因表达量在附睾的不同部位的上皮细胞间存在分布差异。在附睾头、体、尾呈递减性分布。研究显示，体外胚胎发育能力下降与胚胎暴露于氧化应激蛋白p66Shc环境下有关[4]。研究证实，绵羊合子阶段注射p66SHc siRNA会导致p66mRNA的蛋白质水平下降[5]。而敲定p66SHc 能够提升胚胎的基因激活阶段的抗氧化应激能力。从正常绵羊附睾组织获取的附睾头、体、尾组织的p66mRNA基因分布情况看，决定绵羊附睾上皮细胞的生育、细胞凋亡、抗氧化应激能力的基因物质主要集中在附睾头部。

从clumRNA看，附睾头、体部的基因表达量显著高于尾部（P＜0.01）。clumRNA与多种疾病有关，CLU的功能多样，但在不同的区域承担的生物学特性有影响差异。而附睾头、体部基因表达量高于尾部,可见，绵羊附睾上皮细胞的clumRNA主要存在于附睾头、体部，在尾部含量少。综上，在不同的附睾上皮细胞中，参与附睾的功能的主要基因分布情况存在一定差异，但主要以附睾头、体部为主，尾部的上皮细胞的基因分布较低，与附睾尾端的生物功能有关。