一株番茄青枯病拮抗细菌JK19的鉴定及其抑菌活性检测

黄 伟，宋 博，张丽娟，王 博，王 玮

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091，2.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物防治综合治理重点实验室/农业部库尔勒作物有害生物科学观测试验站，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种土传性细菌病害。利用拮抗菌防治青枯病的发生是一种环保而有效方法。目前青枯病拮抗菌的来源大都是农田土壤，拮抗菌的拮抗效果不稳定，且难以应对近年来青枯菌产生的较强耐药性。寻找新的拮抗菌资源，开发新的活性物质对青枯病生物防治有实际意义。【前人研究进展】目前用于防治青枯病的生防细菌主要有无致病力青枯菌、芽孢杆菌、假单胞菌、链霉菌等。其中芽孢杆菌(Bacillussp.)具有环境友好、抗逆性强、定植能力强、繁殖力强、产物丰富、性质稳定的特点，是目前农业生产中应用最多的生防细菌之一。Li等[1]研究了在温室条件下，使用拮抗菌株芽孢杆菌SQRT3(从番茄根际土壤中分离)浸根处理后，对番茄青枯病的生防效率提升至84.1%。郑雪芳等[2]报道菌株FJAT-20261和FJAT-19700分别鉴定为耐寒短杆芽孢杆菌和特基拉芽孢杆菌。在盆栽试验中，二者对番茄青枯病防效达到72.73%和67.77%。【本研究切入点】芽孢杆菌是关注度最高、商业化最成功的生防因子，作为一类广谱抗菌、能诱导植物系统抗性、环境安全性高、兼具促生作用的生防菌具有非常大的市场应用价值。芽孢杆菌Bacillussp. JK19是从耐辐射微生物资源库筛选得到的，对番茄青枯病病原菌具有较强拮抗作用。研究拮抗细菌JK19的分类学地位，检测其抑菌活性。【拟解决的关键问题】JK19广谱抑菌活性，采用形态学和分子生物学及生理生化特征相结合的方法，鉴定菌株，运用PCR方法检测其可能的生防活性成分脂肽类化合物合成基因，为以该菌为基础的生防制剂的研究和开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试菌株：拮抗细菌Bacillussp. JK19由耐辐射微生物资源库保存；番茄青枯病菌购自广东省微生物保藏中心；香梨黑斑病菌由新疆农业科学院植保所分离保存；核桃腐烂病菌、马铃薯早疫病菌、西瓜枯萎病菌、西瓜蔓枯病菌、水稻恶苗病菌、棉花枯萎病菌由中国农业大学李健强教授赠予。表1

表1 植物病原菌Table1 Plant pathogens used for tests

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、营养琼脂培养基(Nutrient Agar，NA)、TTC(Triphey tetrazolium chloride)固体培养基[3](培养基成分为水解乳蛋白1 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，琼脂17 g，pH 6.5～7.0，定容至1 L；使用前冷却至55℃，加入过滤除菌的1%的2，3，5-氯化三苯四氮唑，终浓度为0.005%)、CPG液体培养基(培养基成分为水解乳蛋白1 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，pH 6.5～7.0，定容至1 L)、R2A琼脂培养基。

供试试剂：GEN III微孔板、 API试剂条及相关试剂。

供试仪器：气浴振荡培养箱、高压蒸汽灭菌锅。

1.2 方 法

1.2.1 番茄青枯病拮抗细菌的筛选

采用平板对峙法。以番茄青枯病病原菌为指示菌，接种于CPG液体培养基，30℃ 120 r/min振荡培养24 h，作为指示菌种子液。将指示菌种子液与TTC固体培养基按1∶10比例混合均匀后倒入培养皿。

从耐辐射资源库中将细菌接种于NA固体平板，37℃培养24 h进行活化后，挑取单菌落接种NA液体培养基，37℃ 120 r/min振荡培养24 h作为种子液，取1 mL种子液10 000×g离心1 min，上清液待用。

用打孔器(6 mm)将含指示菌的平板打3个孔，将上清液加入孔内，每孔100 μL，对照为等量的无菌水，37℃静置培养24 h。测量抑菌圈直径。

1.2.2 拮抗细菌的鉴定

菌株JK19的菌体形态特征参照《伯杰氏细菌系统分类手册》进行。菌株的生理生化特性采用API试剂条及Biolog GEN III微孔板测定。

用无菌棉签细菌蘸取NA固体平板上培养24 h的菌落参照API 20NE、API 50CH、API ZYM试剂条使用说明制备菌悬液，接种、培养、检测并记录结果。

将细菌纯培养物接种于R2A琼脂平板，33℃培养24 h。无菌棉签蘸取单菌落，棉签深入含接种液的接种管，上下晃动均匀释放菌体，制备均一菌悬液。将菌悬液倒入V型加样槽，用八道移液器按每孔100 μL的量加入Biolog GEN III微孔板。微孔板在33℃培养箱培养。每隔12 h，用BIOLOG检定系统读板。

菌株的16S rRNA基因鉴定选择通用引物27F和1492R进行扩增测序， PCR扩增均采用25 μL扩增体系，扩增程序：94℃ 4 min；94℃ 30s，65℃ 40s，72℃ 90s，30 cycles；72℃ 10 min 。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带经切胶回收后送公司测序。测序结果通过MEGA7.0软件采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，Bootstrap值设为1 000。

1.2.3 抑菌活性测定

将冻存的菌株JK19接种于NA平板，37℃培养24 h进行活化后，挑取单菌落接种NA液体培养基，37℃ 120 r/min振荡培养24 h作为种子液，取1 mL种子液10 000×g离心1 min，上清液待用。

对植物病原真菌的抑菌活性测定：采用平板对峙法，将病原真菌接种于PDA琼脂平板中间，将拮抗细菌接种于四周。同时接种只含有病原真菌的PDA琼脂平板作为对照。

菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-对峙板菌落直径)/对照菌落直径×100%。

1.2.4 菌株JK19脂肽类合成及促生相关基因PCR检测

采用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取JK19菌株的基因组DNA。采用25 μL PCR体系扩增脂肽类化合物合成及促生作用相关的基因。表2

表2 基因扩增用到的引物Table 2 Primers for PCR amplification

2 结果与分析

2.1 番茄青枯病拮抗菌的筛选

经过筛选平板对峙实验初筛和复筛后，对番茄青病菌有较好拮抗作用的菌有4株，分别为JK2、JK5、JK19、JK20，JK19的抑菌效果显著优于JK2、JK5和JK20，选择JK19进行下一步试验。图1，表3

表3 耐辐射细菌对番茄青枯病菌的复筛拮抗效果结果Table 3 Antagonistic effect of radiation resistant bacteria on tomato bacterial wilt

2.2 菌株JK19的分类鉴定

2.2.1 形态学特征和生理生化特征

研究表明，JK19菌株在NA平板上30℃培养24 h后，形成直径3～6 mm菌落，呈不规则圆形，近白色不透明，干燥，表面褶皱，边缘锯齿状。在R2A平板上，30℃培养24 h后，形成直径2～5 mm菌落，菌落白色不透明，边缘不规则圆形。经革兰氏染色观察，菌株染色革兰氏阳性，菌体形态呈短杆状，菌体大小0.5 ～0.8(μm)×1.5～2.0(μm)，芽孢位于菌体中心或偏中心，大小约为0.5～0.8(μm)×1.0～1.5(μm)。图2

研究表明，JK19与解淀粉芽孢杆菌同源性最近，SIM值为0.521。JK19可以利用糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、D-松二糖、水苏糖、棉子糖、α-D-乳糖、蜜二糖、β-甲酰-D-葡糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、α-D-葡糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲酰葡糖、D-果糖、肌苷、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、肌醇、甘油、D-果糖-6-磷酸、D-天冬氨酸、明胶、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组胺、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、果胶、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖醛酸内酯、D-葡糖酸、D-葡糖醛酸、奎宁酸、丙酮酸甲酯、D-乳酸甲酯、L-乳酸、柠檬酸、L-苹果酸、溴-丁二酸、吐温40、β-羟基-D,L丁酸、乙酰乙酸、乙酸、甲酸54种碳源。耐受pH 5、8%NaCl，对梭链孢酸、D-丝氨酸、醋竹桃霉素、利福霉素SV、二甲胺四环素、林肯霉素、硫酸四癸钠、万古霉素、四唑紫、四唑蓝、萘啶酮酸、氨曲南、溴酸钠敏感。

JK19除BIOLOG结果外还可以利用L-阿拉伯糖、D-核糖、山梨醇甲基-αD-吡喃葡萄糖甙、苦杏仁苷、ARBULIN、七叶灵柠檬酸铁、水杨苷、淀粉、糖原。能使明胶液化，不产H2S，硝酸盐还原、柠檬酸盐、酪素水解、葡萄糖氧化、接触酶、V-P反应呈阳性，吲哚实验、脲酶反应呈阴性。表4

表4 JK19菌株的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of strain JK19

综合菌株JK19的形态特征和生理生化特征，参照《常见细菌系统鉴定手册》，确定菌株JK19属于芽孢杆菌属。

2.2.2 分子鉴定

菌株JK19的16S rDNA序列1 429 bp，序列提交至GenBank数据库，登录号为MN841899。在数据库中进行BLAST比对，与BacillusvelezensisCR-502 16S rDNA序列相似性最大达99.71% 。选取同源性较高的序列构建系统发育树，菌株与BacillussiamensisKCTC 13613亲缘关系最近，序列相似性为99.51%，与BacillusamyloliquefaciensDSM7的16S rDNA序列序列相似性为99.30%。图3

2.3 拮抗菌株JK19的抑菌谱测定

研究表明，菌株JK19对各植物病原菌的抑制率分别为：香梨黑斑病(66.67%)、核桃腐烂病(100%)、马铃薯早疫病(73.33%)、西瓜枯萎病(60.71%)、水稻恶苗病(67.86%)、棉花枯萎病(76.92%)、西瓜蔓枯病(100%)，几乎完全抑制核桃腐烂病、西瓜蔓枯病病原菌的生长。重复试验及数次传代后仍能得到稳定的抑菌结果，菌株JK19具有稳定、高效、广谱的抑菌效果。图4

与正常生长的菌丝相比，处理组PDA培养基内抑菌圈周围的菌丝生长缓慢，抑菌圈边界明显，显微镜下可见基内菌丝顶端膨大、弯曲、畸形，原生质凝聚，菌丝生长受到明显抑制。图5

2.4 菌株JK19 脂肽类化合物相关基因与促生相关基因检测

研究表明，经过PCR扩增，检测到参与脂肽类抗生素合成的基因ituA、ituD、bamC、fenB、fenD、srfAB；参与生长素IAA合成的基因ysnE，具有促生作用的基因yndJ。表5

表5 PCR产物序列比对Table 5 Alignment results of PCR product

3 讨 论

3.1 菌株JK19的鉴定

经过形态学、生理生化特征的分析，确定JK19菌株属于芽孢杆菌属，与解淀粉芽孢杆菌较为相似。在分子水平上与暹罗芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌相似性都大于99%。依据现有信息，尚无法将JK19鉴定到具体的种。同时参照其它脂肽类合成基因的序列比对结果，与多株已发表的贝莱斯芽孢杆菌菌株基因组中的相关基因同源性最高，JK19可能是一株贝莱斯芽孢杆菌，然而想要将菌株JK19精确鉴定到种，需要进一步做包括基因组测序、数字DNA杂交在内的生物信息学分析。

2005年研究者发现报道贝莱斯芽孢杆菌BacillusvelezensisCR-502，16S rDNA与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌相似度高于98%，但是菌株DNA-DNA杂交率均低于20%(细菌新种鉴定金标DNA-DNA相关性≤70%。)[9]。此后贝莱斯芽孢杆菌一度被认为是解淀粉芽孢杆菌的同物异名[12]。2016年Dunlap等[13]通过比较基因组学和数字DNA杂交方法重新讨论贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种、甲基营养型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌的分类学地位，指出贝莱斯芽孢杆菌不是解淀粉芽孢杆菌的同物异名，同时甲基营养型芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌植物亚种是贝莱斯芽孢杆菌的同物异名，统称贝莱斯芽孢杆菌，此后贝莱斯芽孢杆菌作为独立的分类单元及其有效的物种名称存在。2017年FAN等[14]就B.amyloliquefaciens、B.velezensis、B.siamensis提出了一个全新的概念“operational groupB.amyloliquefaciens”，他们首先对芽孢杆菌属中的23株代表性模式菌株的核心基因组进行系统发育分析，从中确定了4个与B.amyloliquefaciensDSM 7T高度相似并具有有效命名的菌种，分别是B.siamensis、B.velezensis、B.methylotrophicus、B.amyloliquefacienssubsp.plantarum；其次在NCBI数据库中获取这4个菌种和B.amyloliquefaciens系列内的66株细菌的全基因组序列进行比较基因组分析，进一步证实了Dunlap等[13]的结论，建议将“operational group ‘B.amyloliquefaciens’”作为枯草芽孢杆菌群(Bacillussubtilisgroup)分类等级下的一个新分类单元，其中包括B.amyloliquefaciens、B.siamensis、B.velezensis[14]。目前仅通过表型和16S rDNA序列尚不足以鉴定这几种近源菌群。

3.2 菌株JK19的抑菌活性

无论是解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌还是枯草芽孢杆菌，在农业生产中都有着广泛的开发应用，以芽孢杆菌活体及其产物为基础开发的生防制剂被用以防治多种农作物病虫害[15-18]。研究的JK19菌株对多种植物病原菌均有较好的抑制作用，对核桃腐烂病、西瓜蔓枯病病原菌几乎完全抑制，具有稳定、高效、广谱的抑菌效果。

已报道的芽孢杆菌抗菌产生的拮抗物质主要包括抗菌蛋白、脂肽类抗生素、由非核糖体多肽合成酶(NRPS)和聚酮化合物(PKS)合成的抗生素，部分菌株具有ACC脱氨酶活性，能够分泌IAA，促进植物生长。其中脂肽类抗生素是芽孢杆菌源主要开发的抗菌物质之一，该类化合物主要包括：表面活性素、伊枯草素、丰原素[19]。丰原素对丝状真菌具有较强拮抗作用，对细菌和酵母无作用[20,21]；伊枯草菌素具有较强的抗真菌和溶血活性，有部分抑制细菌的活性；表面活性素有抗病毒、抗细菌活性，没有明显的抑真菌活性，但是表面活性素与丰原素或伊枯草菌素共同使用可以显著提高抑真菌效果[22,23]。脂肽类物质除抗菌活性外，还能促进芽孢杆菌在根部定植，诱导植物系统抗性，显示出极大的生防潜力。

Liu等[24]研究发现B.velezensisH3的抗真菌物质主要是C14-Surfactin和C15-Surfactin。金清等[25]发现B.velezensisS3-1具有广谱抑菌效果，产生6种表面活性素、3种伊枯草菌素、4种丰原素，并对其基因组中脂肽抗生素合成基因簇进行了定位。朱弘元等[26]发现解淀粉芽孢杆菌B15抑制葡萄灰霉病菌的主要活性物质是伊枯草菌素A和丰原素。研究在JK19菌株中检测到3类脂肽类抗生素合成相关的基因，其中ituA、ituD、bamC参与合成伊枯草菌素，fenB、fenD参与合成丰原素，srfAB参与合成表面活性素。结果表明，该菌可能可能通过脂肽类抗生素发挥抑菌作用，同时还发现该菌基因组中有IAA合成和促生作用相关的基因，菌株在具备抑制植物病原菌作用的同时可能具有促生作用，具有较高的开发应用潜力，但有关该菌的抑菌作用机理、代谢产物及环境安全评价等方面的研究还需要进一步完善。

4 结 论

筛选得到的生防拮抗菌JK19，经鉴定为芽孢杆菌属，该菌对番茄青枯病病原菌等多种植物病原菌均具有明显的抑制作用。参与脂肽类抗生素合成的基因ituA、ituD、bamC、fenB、fenD、srfAB；参与生长素IAA合成的基因ysnE，具有促生作用的基因yndJ均被检测到。