173对生育异常夫妇的外周血染色体核型分析

王艳丽 位婷婷 张超楠 刘新新 郝戈芳 李乐瑶 郭文文

（河南省生殖健康科学技术研究院、国家卫生健康委出生缺陷预防重点实验室、河南省人口缺陷干预技术研究重点实验室，河南 郑州 450002）

生育异常在临床上比较常见，主要包括不孕不育（指育龄夫妇同居且未避孕，女方1年未受孕），不良孕产史（指既往有异常妊娠史，主要包括胚胎停育、胎儿畸形、死胎、流产史、产后大出血等）。引起不良孕产史夫妇的原因十分复杂，包括免疫、遗传、内分泌、感染、环境等因素［1］。随着现代人们生活方式的改变、环境的改变、性传播疾病发生率逐年增加和年轻化等因素，导致不孕不育症的病发率呈增长趋势，对社会和家庭带来很大困扰［2，3］。

遗传因素是生育异常的重要原因之一，目前临床上尚无有效手段治疗染色体病。夫妻双方行染色体检查是出生缺陷一级预防的重要手段，有助于临床遗传咨询工作。本文通过回顾性分析来本院就诊的173对夫妇染色体核型结果，探讨外周血染色体核型异常和染色体多态性对生育的影响，为优生优育，遗传咨询提供临床借鉴。

1 资料和方法

1.1 研究对象 筛选2016年9月至2019年3月期间来本院就诊的173对夫妇，年龄19～40岁，平均30岁，临床诊断为不孕不育，不良孕产史（临床表型主要包括胚胎停育、胎儿畸形史、复发性流产等）。

1.2 方法

1.2.1 实验原理 染色体带型是指运用一种或多种显带技术，使得染色体某个区域和附近的片段比较起来，显得深染或浅染，这个明显和周围区别的区域就命名为带。本文采用G显带方法，通过培养人外周血细胞，获取大量增殖的有核细胞（主要指淋巴细胞），经过一系列处理，使核内处于分裂中期的染色体暴露出来，固定在载玻片上，并通过胰酶消化和吉姆萨染色方法，使染色体呈现深浅不同的带型，DNA结合疏松的组蛋白被胰蛋白酶分解掉，染色后这些区段成为浅带，而那些组蛋白和DNA结合牢固的区段可被染成深带。通过条带识别，核型分析，判断染色体是否存在异常及异常的方式。

1.2.2 实验步骤

1.2.2.1 接种收获 取样均取得患者同意并签署前知情同意书。采患者外周血2～3ml于肝素钠抗凝管中，使用注射器将外周血接种到2个培养瓶（含培养基6ml）内，每瓶用2.5ml注射器注入30滴，在37℃恒温培养箱中孵育72h。提前半小时从培养箱中取出外周血培养瓶，每瓶加入8～10滴秋碱（浓度为0.03%～0.04%），37℃水浴20min，将外周血转移至15ml离心管内，1800rpm离心6min，每管加入低渗液（0.075mol／l KCl）至10ml刻度，37℃水浴35min，用固定液（甲醇∶冰乙酸＝2∶1）进行预固定及第一次固定，再用固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶1）进行第二次固定及第三次固定。

1.2.2.2 滴片显带 将上述细胞悬液悬空滴2～3滴于洁净冰冻载玻片上，每人滴4张片子。过火焰，80℃烤片2h，用胰酶显带，吉姆萨染液染色后，使用染色体核型分析软件进行分析处理。

1.2.3 外周血染色体核型分析原则 本研究结果处理原则：每个样本分析5个细胞，所分析细胞的染色体分辨率应达到320条带水平。至少计数20个细胞，记录任何观察到的染色体数目或结构异常。对可能有性染色体异常病例的标本，至少计数30个细胞。对于嵌合体（由2种或多种具有不同核型的细胞系所组成的个体称为嵌合体），依据计数100个核型中异于主细胞系的核型≥3个，则结果报为嵌合体，并标注嵌合比例。本研究则在400～550条带水平对外周血染色体进行核型分析，分辨率更高，可分辨＞5Mb的染色体数目异常和结构异常。命名原则依据人类细胞基因组学国际命名体系（2016）［4］的有关规定命名。

2 结果

173对夫妇按就诊原因中不良孕产史分为胚胎停育、胎儿畸形、复发性流产及其他4组。173对夫妇的就诊原因和占比情况见表1。

表1 173对夫妇的就诊原因和占比情况（n＝173）

173对夫妇共346例染色体结果中异常核型16例（其中2对夫妇双方核型都异常，13对夫妇只有一方核型异常），异常检出率为4.6%。其中女性异常6例，占总异常核型的37.5%；男性异常10例，占总异常核型的62.5%。染色体多态性24例。

本文异常核型中检出数目异常核型1例，男方核型为超雄综合征47，XYY，临床表现为无家族史，外貌正常，智力发育正常，肌张力正常。女方核型正常，但生育异常。检出染色体结构异常12例，平衡易位核型11例，未知结构增加核型1例。检出11号染色体臂间倒位1例，临床表现为其妻复发性流产。染色体多态性核型中检测出9号倒位4例，异染色质区增加4例，异染色质区减少1例，随体柄增加15例。具体异常染色体和染色体多态性核型统计见表2，本文典型正常核型分析图见图1，本文典型异常核型和染色体多态性核型分析图见图2。

图1 本文典型正常核型分析图

图2 本文典型异常核型和染色体多态性核型分析图，箭头所指为异常核型定带位置

表2 染色体异常核型和染色体多态性列表

3 讨论

染色体存在于细胞核内，是遗传信息的主要携带者，是遗传基因的载体。染色体异常是导致新生儿出生缺陷的主要原因，可以引起女性不孕不育、流产、死胎、胎儿畸形及胎儿生长发育受限等不良后果［5］。

染色体异常包括染色体数目异常和结构异常。染色体数目异常分为亚二倍体、超二倍体、三倍体、多倍体等；染色体结构异常包括缺失、重复、倒位、易位等。染色体异常会导致染色体病，如Patau综合征（47XX／XY，＋13）、爱德华氏综合征（47XX／XY，＋18）、唐氏综合征（47XX／XY，＋21）、特纳综合征（45，X）、猫叫综合征（46，XX／XY，5P－）等［6］。一般在胚胎早期即引起自发流产，存活者通常表现有生长发育迟缓、智力低下、先天性畸形和性发育异常等［7］，给家庭带来感情上的创伤和社会经济上的严 重负担。染色体异常胚胎的形成，除了高龄的原因外，大部分是由于父母一方或者双方染色体异常，在受精卵形成过程中形成了异常的配子导致的。

3.1 染色体核型异常与生育异常的相关性 本文结果显示，染色体核型异常检出率为4.6%，其中染色体结构异常的检出率为3.7%，结构异常中易位核型占比3.5%（平衡易位占比2.3%，罗伯逊易位占比1.2%）；倒位核型占比0.3%；未知染色体增加核型占比0.3%。染色体数目异常的检出率为0.3%，远低于染色体结构异常。

3.1.1 平衡易位并不导致染色体整体性的减少或增加，通常无表型异常，因此很难发现。本文结果显示，平衡易位者大多不影响怀孕，但却是导致胎儿流产、死胎、新生儿畸形的重要原因［8-10］。夫妻一方为染色体平衡易位携带者时，生育正常核型后代的概率是1／18，生育平衡易位携带者后代的概率是1／18，胚胎早期停育或生育严重染色体病患儿的概率是16／18。该夫妇严格避孕，若自然受孕，胎儿发育至孕18～24周时需进行产前诊断，或该夫妇可行胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genome diagnosis，PGD）技术获取后代，以避免因新生儿出生缺陷给家庭带来的不良后果。

3.1.2 罗伯逊易位属于特殊类型的易位，分为同源型和异源型，通常发生在D组和G组核型之间，两个染色体的长臂和短臂分别相连，因短臂只有异染色质区，易丢失，因此核型命名为45条染色体。对于同源罗氏易位核型，该种罗氏易位患者生育时，因为所有胚胎都会携带单体或三体，而这些染色体是有问题的，建议通过供体配子（供体人工授精、供体卵）获取后代。若夫妻一方为非同源罗伯逊易位携带者，生育正常后代的概率是1／6，生育罗氏易位携带者后代的概率是1／6，胚胎早期停育或流产的几率是4／6，该夫妇若自然受孕，胎儿发育至孕18～24周时需进行临床遗传咨询，做产前诊断检测，该夫妇也可通过技术获取后代［11］。

3.1.3 染色体倒位分为臂内倒位和臂间倒位，倒位不影响携带者表型，但倒位的长短，影响胎儿成活，易引起流产［12］。若夫妻一方为臂间倒位携带者时，其子代1／4染色体正常，1／4为染色体倒位携带者，2／4为染色体不平衡性异常；若夫妻一方为臂内倒位携带者时，其子代1／4染色体正常，3／4为染色体异常。建议该夫妇若自然受孕，胎儿发育至孕18～24周时需进行临床遗传咨询，做产前诊断检测，该夫妇也可通过PGD技术获取后代。

3.1.4 染色体数目异常中，47，XYY综合征，又称超雄综合征，在临床上较少见，属于性染色体异常疾病，患者多数具有生育能力，但少数有生精障碍，可能原因是多余的Y染色体影响了精子的生成引起的［13］。

染色体多态性属于非病理性差异，但是近年来有研究发现染色体多态性与不孕不育，复发性流产等临床表现相关［14］。其中，1、9、16号染色体由于高度重复的DNA序列引起有丝分裂的异常进行，而染色体短臂增长可形成异常配子，导致生育异常的发生［5］。染色体多态性核型中以随体柄增加（stk＋）和异染色质区（qh＋）增加或减少（qh-）为主。

研究报道，9号染色体臂间倒位与不孕不育、流产、胎儿发育异常相关［15］。有学者认为9号染色体臂间倒位是否有临床意义与其具体倒位发生的区段有关系［16］。临床中的9号染色体臂间倒位通常指的核型为46，XX，inv（9）（p11q13），目前临床工作中尚未见9号染色体臂间倒位有位于9p11q13区间以外的形式，本研究共检出9号染色体臂间倒位者3例，其中女性2人，男性1人，占总人数的0.87%，与梁济慈等［18］报道的9号染色体臂间倒位在生育异常中的比例0.87%相近［17］，而略高于代海兵等报道的0.46%。夫妻一方为9号染色体臂间倒位携带者，若自然受孕，胎儿发育至孕18～24周时需进行临床遗传咨询，做产前诊断检测。

综上所述，染色体核型异常和染色体多态性与生育异常密切相关。因此，对生育异常夫妇进行外周血染色体检查是必要的检测手段，为临床孕前遗传咨询提供依据，有利于做好出生缺陷防控工作，促进优生优育，减轻家庭和社会负担。