苍耳子配伍辛夷治疗变应性鼻炎的网络药理学探究

肖茂春 刘淑云 张雨菲 王立宇 殷泽登

变应性鼻炎（Allergic Rhinitis,AR）是一种常见的慢性呼吸道疾病，其患病率不断上升，对患者健康和社会经济造成很大的负担[1，2]。中医药在AR治疗中发挥重要的作用，研究证实苍耳子和辛夷均有抗炎、抗过敏、抗组胺等作用，两者配伍后可降低苍耳子的毒性作用，并增强抗炎作用[3，4]，但两种药物配伍治疗AR的生物学机制目前还没有阐明。本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台筛选苍耳子及辛夷的活性成分，预测活性成分的生物靶点，构建活性成分-靶点网络和抗AR靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络，从整体上探索苍耳子配伍辛夷治疗AR的潜在生物学机制，为临床研制新的治疗AR的药物提供思路。

资料与方法

1 筛选苍耳子及辛夷有效成分

在TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）“Herb name”检索窗口分别输入苍耳子及辛夷，选择生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，筛选出苍耳子和辛夷的有效成分，并检索确定有效成分可能的作用靶点。

2 筛选潜在靶点

将苍耳子及辛夷的潜在作用靶点输入Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）转化成与人类对应的基因名称。分别在OMIM数据库（https://omim.org/）、Genecard数据库（https://www.genecards.org/）、NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和PGKB数据库（https://www.pharmgkb.org/）中检索与“allergic rhinitis”相关的基因，取上述靶基因并集作为AR的靶基因集，并将药物有效成分的潜在作用靶基因和AR的靶基因集对比取相交区域，获得苍耳子及辛夷治疗AR的有效成分的靶基因。

3 构建蛋白相互作用网络

将筛选出的苍耳子和辛夷的靶基因导入String Version 11数据库(https://string-db.org/），选择默认设置，将结果中的“node1,node2,combined Score”信息导入Cytoscape 3.7.1软件中，作图并分析。分别采用节点的大小与边的粗细来反映degree及combined score的大小，最终获得蛋白-蛋白相互作用网络。

4 分析生物过程和通路

在https://www.r-project.org/下载、安装R软件，采用R平台对苍耳子和辛夷治疗AR的有效成分的靶基因进行基因本体（GO）生物过程和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析（以P＜0.05为标准判断相关性）。

结果

1 苍耳子配伍辛夷的有效活性化合物

TCMSP数据库检索，得到了111个苍耳子的化学成分，184个辛夷的成分，符合OB值≥30%，DL≥0.18筛选条件的有11个苍耳子的活性成分，19个辛夷的活性成分，见表1。

表1 苍耳子和辛夷活性成分及部分参数

药物 TCMSP编号 Molecule Name OB MOL012130 (2S,3R,3aR,7R,7aS)-7-allyl-2-(1,3-benzodioxol-5-yl)-3a,4-dimethoxy-3-methyl-2,3,4,7a-tetrahydrobenzofuran-6-one 59.37 DL 0.51 MOL012131 isodihydrofutoquinol a 60.54 0.36 MOL012136 5-p(2S,3S,4R,5R)-5-(3,4-dimethoxyphenyl)-3,4-dimethyl-2-tetrahydrofuranyl]-1,3-benzodioxole 60.11 0.45 MOL012137 magnolone 50.56 0.55 MOL000310 Denudatin B 61.47 0.38 MOL000313 Galgravin 57.12 0.39 MOL00314 (2S,3S,4S,5S)-2,5-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-3,4-dimethyltetrahydrofuran 57.12 0.39 MOL001494 Mandenol 42.00 0.19 MOL000315 hancinone 39.31 0.44 MOL007563 Yangambin 57.53 0.81 MOL009849 ZINC05223929 31.57 0.83

2 AR相关靶基因的筛选及与药物靶基因的对比分析

利用Genecard等四个数据库，收集了AR相关靶基因1590个，与苍耳子及辛夷筛选后得到的活性成分的38个靶基因进行交集分析，得到18个抗AR靶基因（图1中相交区域）。

图1 变应性鼻炎靶基因与两种药物靶基因交集图

3 苍耳子配伍辛夷有效分子与抗AR靶点基因的网络图

运用Cytoscape3.7.1软件将药物有效成分以及抗AR靶点基因制作成网络图（图2），绿色代表抗AR的靶基因，黄色代表药物有效的成分，连线代表各自间的作用关系。

图2 两种药物抗变应性鼻炎靶点基因的网络图

4 苍耳子配伍辛夷抗AR靶点PPI网络构建

利用String Version11，预测和构建18个抗AR靶点蛋白-蛋白的作用分子网络，通过节点度（degree）等拓扑参数评价靶点的重要性，其中CASP3、ESR1、MYC、CASP9、BCL2、GSK3B等蛋白靶点的度值较高，度值越高，关键靶蛋白的可能性越大，而PTGS1蛋白质与其他17个蛋白质无相互作用（图3）。

图3 两种药物抗变应性鼻炎靶点蛋白相互作用预测网络

5 苍耳子配伍辛夷抗AR的GO生物功能分析

在对18个潜在靶点GO生物过程富集分析中，发现其主要富集在细胞增殖、细胞生长、信号转导、凋亡通路以及细胞对药物反应等43个生物过程中（P＜0.05），表2展示P＜0.005的生物过程。研究表明上述生物过程在AR中起到了重要的抗过敏、抗炎作用。在GO分子功能富集分析中，我们发现其与胺受体、核受体和类固醇激素、转录因子、神经递质等受体活性的调节密切相关，见图4。

表2 两种药物抗变应性鼻炎靶点GO生物过程分析结果（P＜0.005）

图4 两种药物抗变应性鼻炎靶点GO分子功能分析结果

6 苍耳子配伍辛夷抗AR的KEGG富集通路分析

在KEGG通路富集分析中发现，18个靶点主要富集在18条信号通路上，主要有PI3K-Akt、甲状腺激素、细胞凋亡、结直肠癌、前列腺癌、乙型肝炎等相关信号通路，这些通路互相作用，调节细胞的增殖、分化、代谢等多种生物学功能，见图5。

图5 两种药物抗变应性鼻炎靶点KEGG富集通路分析结果

讨论

据统计，全球AR发病率10%～20%，防治AR成为全球关注的焦点和难点[1]。2015版中国药典提到苍耳子和辛夷功能主治散风寒，通鼻窍，祛风湿，用于风寒头痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊等[5]。研究表明苍耳子具有良好的抗过敏、抗炎和镇痛作用，可以减少喷嚏和鼻痒症状的发作频率，辛夷具有抗过敏、抗炎、血管生成、抗增殖、Ca2+通道拮抗和抗微生物活性等药理作用，二者均有抗过敏、抗炎的作用[6，7]。临床应用中，多见以苍耳子配伍辛夷的汤剂或者制剂治疗鼻炎或者变应性疾病，而且其治疗疗效得到了肯定[8-10]。药对是沟通单药与复方中药的桥梁，以药对为研究对象，可以避免复方中成分、剂量、炮制方法等复杂的问题[11]。苍耳子－辛夷是经典的药对，研究发现该药对挥发油可明显抑制皮肤的过敏反应[12]，可减轻AR豚鼠鼻黏膜病理变化，改善鼻部行为学症状[13]。研究证实苍耳子配伍辛夷可以增强抗炎作用，并降低苍耳子的毒性作用[3，4]，但其治疗AR的主要活性成分和分子机制尚未完全阐明。为传统医学更好的推广，研制新药，减轻疾病负担，故开展此研究。

随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学的发展，越来越多的学者采用现代先进技术从基因表达、蛋白质修饰、分子通路等方面解释中医药相互配伍治疗疾病的作用机理[14]。由于中药材的多组分、多靶点、多通道的特点，其作用机制的确定比较困难。本研究从蛋白质相互作用、GO与KEGG富集分析等方面分析了苍耳子配伍辛夷治疗AR的药理活性成分和可能的分子网络，以探讨两者配伍在AR治疗中的潜在作用机制。首先通过网络药理学的方法和技术，构建了不同层次的网络，如药物成分-靶点网络构建、靶点蛋白相互作用网络构建、KEGG通路富集分析等，然后对上述网络进行比较分析。通过蛋白质相互作用分子网络，我们发现中心度较高的靶点有CASP3、CASP9、BCL2、ESR1、MYC、GSK3B等，其中CASP3、CASP9是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族成员，参与炎症的调节和细胞的凋亡，起到了重要的抗炎作用[15，16]。ESR1激活后能减少炎症介质的生成从而抑制炎症反应，研究表明其他的类固醇激素受体，如：糖皮质激素、雄激素，在治疗鼻炎中也起到了重要作用[17，18]。此外，BCL2是一种凋亡抑制因子，研究证实气道炎症模型中，BCL2蛋白在鼻黏膜、肺等组织的炎症细胞中表达增高，而Bcl-2抑制剂可以有效减少嗜酸性粒细胞或中性粒细胞介导的气道炎症反应[19]，全基因组关联研究确定了MYC为致敏的重要基因之一[20]。

苍耳子配伍辛夷抗AR是多靶点、多通路相互作用和相互影响的结果。通过AR相关靶点的GO富集分析，发现苍耳子配伍辛夷抗AR涉及的生物学过程可能与细胞增殖、细胞生长、信号转导、凋亡通路以及细胞对药物的反应有关，已有研究证实上述生物学过程参与了抗AR作用[21，22]。苍耳子配伍辛夷抗AR涉及的分子功能主要富集于核因子、转录因子、类固醇激素、神经递质等受体活性的调节。KEGG信号通路富集分析结果显示，苍耳子配伍辛夷抗AR作用可能与多条信号通路有关，涉及PI3K-Akt、甲状腺激素、细胞凋亡信号、结直肠癌、前列腺癌、乙型肝炎等相关信号通路。AR属于IgE介导的I型变态反应，与众多Th2细胞因子（如:IL-4、IL-5、TL-6、TNF）以及这些因子所介导的炎症通路有关[23]。两种药物抗过敏、抗炎的靶标也表达于抗癌通路中，研究证实AR的发病率与乙型肝炎携带者呈正相关，可能与调节性T细胞调控IL-10等抗炎细胞因子的表达而下调Th1和Th2应答有关[24]。而AR、哮喘的发病率与癌症的发病呈负相关，研究学者推测可能是IgE介导的反应发挥了免疫监视的重要作用，其次，嗜酸性粒细胞可能具有重要的抗肿瘤作用[25]。本研究发现PI3K-Akt信号通路参与基因最多，共6个，且可信度较高，研究证实PI3K-Akt信号通路可抑制肥大细胞的活化和增强抗炎因子的表达从而发挥抗AR作用[21，26]。

综上所述，苍耳子配伍辛夷能够调控以CASP3、CASP9、BCL2、MYC、ESR1、MYC等基因为中心的分子网络，具体机制可能与PI3K-Akt、甲状腺激素、细胞凋亡信号、结直肠癌、前列腺癌、乙型肝炎等相关通路间的相互作用有关，为进一步验证苍耳子配伍辛夷抗AR的有效成分，并阐明其作用机制提供了新的思路和切入点。未来研究需要以网络药理学预测结果为导向，通过进一步研究进行验证，在此基础上研发新的治疗AR的药物。