脱苦风味蛋白酶的研究进展

赵普瑛 曾小英 覃瑞 王靖 熊海容

基金项目：湖北省技术创新专项重大项目（项目编号：2018ABA093）。

作者简介：赵普瑛（1996—），女，在读硕士研究生，研究方向：微生物酶工程。

通信作者：熊海容（1966—），男，博士，教授，研究方向：微生物酶工程。

摘要：综述食品蛋白水解产物苦味产生的研究进展和近年来利用风味蛋白酶脱苦的方法，为新型风味蛋白酶类产品开发提供科学依据。

关键词：风味蛋白酶;肽酶;苦味肽;脱苦

风味蛋白酶是一类在中性或酸性条件下能改善食品口味和口感的蛋白酶和肽酶[1]。食品风味主要与一些芳香化合物、糖类物质、游离氨基酸和肽类等物质有关，食品的气味主要与酯类、酮类等芳香类化合物有关，口味中咸味主要由氯化钠产生、酸味主要是乳酸作用，而甜、鲜、苦味主要与游离氨基酸和一些寡肽相关[2]。风味蛋白酶主要作用于这些风味肽，来调节食品蛋白质水解物的甜、鲜和苦味，而这3种味道与对食物的接受度有关，甜、鲜味使食物易于被接受，而苦味则不利于对食物的接受[3]。苦味是生物进化而来的一种趋利避害的信号，大多数动物本能地厌恶苦味物质。虽然人们也对某些食物的苦味有偏爱，巧克力、咖啡中的咖啡因，啤酒中的α-酸、β-酸、异α-酸、酮类物质[4]，红酒中的多酚，白酒、黄酒中的高级醇和苦味肽[5]，茶叶中的咖啡碱、可可碱、茶叶碱、花青素类、茶叶皂苷、苦味氨基酸及部分黄烷醇类等苦味物质会增加这些食品的风味。但是如豆制品、奶制品中的苦味肽、莴苣等菊科蔬菜中的倍半萜内酯[6]等引起的不良口味，会影响食用体验，进而影响其商品的销售情况。

蛋白质水解物在食品工业中有广泛的应用，可作为专用饮料中的氮增强剂，普通/特定人群的肠内/肠外营养的预消化成分，有益生理功能的浓缩/分离肽制剂，细胞培养/细菌生长培养基的成分，以及作为化妆品和保健品的成分，还可用作多种用途的乳化剂，如沙拉调味料、涂抹食品、冰淇淋、咖啡增白剂和乳化肉制品，如香肠或午餐肉[7-8]。发酵、陈化等是食品加工中重要的生产方式，在这些食品加工过程中，蛋白质经蛋白酶水解成多肽或氨基酸等小分子物质，还会通过水解破坏致敏表位，降低致敏潜力，利于人体摄入和吸收[9]。但是，在这些过程中，它们会不可避免地在水解蛋白质时产生苦味肽，影响食品的风味，使其不易被人们接受。因此，苦味肽的形成是食品蛋白水解物实际应用中最严重的问题。蛋白质水解物的苦味是阻碍它们推广应用的一大难题。因此，脱苦技术应运而生，用于降低蛋白质水解产物的苦味值。

目前，为了解决苦味限制食物蛋白质的感官可接受性的问题，人们使用多种方法来防止、去除或掩盖多肽的苦味[7，10-11]，其中，酶法脱苦主要利用风味蛋白酶来实现。酶法脱苦与其他一些方法相比具有一些优势：（1）酶解过程温和，不会破坏蛋白质原有的功能性质;（2）酶主要来源于生物，低毒甚至无毒，与化学方法相比，更加安全;（3）最终水解产物经平衡后，含盐极少，且最终产品的功能性质可通过选择特定的酶和反应因素加以控制;（4）蛋白水解物易被人体消化吸收且具有特殊的生理功能。

1苦味肽致苦因素

苦味肽是蛋白质水解产物中呈现苦味的寡肽，大多由不超过8个氨基酸组成[12]，少数由10个以上氨基酸构成，甚至有长达39个氨基酸的苦味肽。目前，据BIOPEP-UWM数据库统计，已鉴定出呈味氨基酸和呈味肽483种，其中苦味氨基酸和苦味肽有332种。蛋白水解物的苦味与多种因素相关。

1.1疏水性

肽链的疏水性是影响其苦味的决定性因素。Ishibashi等[13-15]经过对苦味肽的一系列研究发现，多肽是否含有疏水氨基酸，疏水氨基酸在肽链中什么位置对苦味的产生有显著影响。其中，Leu对于多肽苦味有显著影响，且位于C-端时苦味值更高[13];Phe和Try位于多肽末端时，且多肽中Phe含量与Try含量的比值越高，多肽越苦[15]。Matoba等[16]发现，当疏水氨基酸在多肽内部时要比它位于多肽两端时苦。Gomez等[17]发现，奶酪的苦味与其水解产物的疏水性和亲水性多肽及氨基酸的比率有关，从另一面说明，食品水解产物的苦味与其疏水性有关。

最经典的估测多肽苦味值的Q值计算就是建立在对肽链平均疏水性上的[18]，至今为止，这也是预测多肽苦味的可靠依据。Ney提出Q值计算公式如式（1），Δf指肽链的整体疏水性、n指组成该肽链的氨基酸个数。式（1）在多肽分子质量小于6 000 Da时有效，Q值小于1 300 cal/moL，肽无苦味;Q值大于1 400 cal/moL时，则有苦味;Q值在1 300～1 400 cal/moL之间时，无法预测多肽苦味[18]。

1.2结构

氨基酸侧链结构对苦味肽苦味值有影响。氨基酸若产生苦味，其侧链骨架至少要由3个碳原子组成，侧链中碳原子数量和所在位置决定苦味强度，侧链结构对此也有影响，但这种影响非常小[14]。碳原子数量越多，氨基酸越苦;同等條件下，有位于γ位点的氨基酸比有位于β位点的致苦性强;含线性侧链的比含分支侧链的氨基酸致苦性强[14]。肽链末端结构也影响苦味。金贤玉等[19]构建了一个有224个长2～14个氨基酸的多肽和5个氨基酸组成的苦味肽数据库。他们发现，多肽C端粗大的疏水氨基酸和N端的粗大碱性氨基酸与肽链苦味高度相关。蛋白质末端的封闭结构也会增强苦味，肽段两端都被乙酰化或酯化封闭的肽比仅一端封闭的肽要苦[16]。对于仅封闭一端蛋白质的情况又有所不同，只封闭氨基端时，减轻多肽苦味;而只封闭羧基端时，苦味会增加[16]。苦味与肽链环状结构也有关，苦味肽典型的结构就是环状二肽分子模型[20]。疏水氨基酸在肽段中的位置对苦味有影响。当疏水氨基酸位于长链肽的内切位置时，该肽比位于末端位置时更苦;而疏水氨基酸在短肽中的情况，与之相反[21]。

1.3分子量

根据Q值计算条件，该方法只限于分子质量在6 000 Da以下的蛋白质使用;而对于分子质量大于该限度的蛋白质，即使Q值大于1 400 cal/moL，也无法确定该蛋白质是否呈苦味[18]。这可能是因为分子量大的肽链，是长肽，易形成稳定空间结构，将疏水基团包裹掩盖起来，而分子量相对小的肽链，即短肽，易暴露其疏水基团，呈苦味[22]。据研究表明，目前商品大豆蛋白水解物的苦味与1 000～4 000 Da的中等分子质量范围的多肽有关。当将大豆蛋白水解物由3 000 Da水解至2 000 Da之后，苦味增加，但是当分子量降至1 000 Da以下时，苦味逐渐降低[23]。

1.4水解度

Leksrisompong等[24]利用2，4，6-三硝基苯磺酸法评价了乳清蛋白水解物水解度（DH值），比较了DH与不同分子量多肽的苦味和氨基酸浓度的关系。他们发现较高的苦味与低浓度2 000～10 000 Da大小的多肽和高浓度低分子量多肽5 000～1 000 Da相关，得到了苦味的强度与DH呈正相关的结论。该因素致苦的原理与多肽疏水性氨基酸残基和其长度对苦味的影响相关。在完整的蛋白质中，大多数疏水氨基酸都朝向分子内部，然而，在蛋白水解过程中，含有疏水氨基酸的多肽被释放出来，并与味蕾相互作用，产生苦味。随着蛋白水解的继续，更多的疏水氨基酸残基暴露出来，因此，水解产物的苦味通常会随着水解程度的增加而增加[25]。1 000 Da以下多肽随着水解，苦味会降低，可能是因为肽端疏水性氨基酸残基被水解下来，苦味肽结构被破坏，或是产生的游离的疏水性氨基酸没有苦味肽苦。

1.5水解蛋白质所用的蛋白酶种类

目前，有很多人在对现有的商品化蛋白酶水解蛋白质产生低苦水解物的能力进行比较，发现不同的商品酶在脱苦上的效果有明显差异，这说明水解产物的苦味与所用酶的专一性有关。因为不同的酶有不同的偏好，水解不同的位点，产生不同长度的多肽，暴露出疏水性氨基酸的程度不同，因此，产生苦味的强弱不同。

2感受苦味肽机制

Ishibashi等[26]通过研究脯氨酸残基在多肽苦味中的作用，证明了多肽产生苦味的必要条件：含有2个苦味决定位点，它们在多肽的空间构象上应该相邻。它们通过对Arg-Gly和Gly-Arg的苦味测定，推测精氨酸位于N-末端时，其苦味较強烈;通过对Arg-Pro的测定，判断Pro的亚胺环参与了疏水集团的作用，这初步证实了Okai对于苦味机理的假设。Okai推测疏水亚胺环的功能是与苦味感受器（T2Rs）结合的结合单元（BU），而邻近的精氨酸残基在刺激单元（SU）中起作用，只有当二者共存时，苦味才会显现出来。据悉，T2Rs属于7跨膜G蛋白偶联受体家族[27]，组成一个约15 的口袋，容纳苦味物质。BU和SU应在口袋底部。BU识别苦味肽疏水性氨基酸残基，并与之结合，SU识别并结合疏水性氨基酸或碱性氨基酸残基结合。Ishibashi等[20]人之后进一步发现了苦味二肽的典型的环状二肽分子模型，并确定了两个苦味决定点：第一个（主要）决定点为疏水基团，第二个（次要）决定点为疏水集团或较大的碱性基团，并测出这2个位点的距离为4.1。

据报道，哺乳动物[28]或像鸡[29]这样的鸟禽类动物都是通过G蛋白受体来转导苦味信号的。G蛋白和杆状转导蛋白在味觉感受器细胞（TRC）中表达，TRC大致分为三类：T1Rs、T2Rs和T3Rs。T1Rs感受甜味和鲜味，T2Rs主要感受苦味，也可感受鲜味，T3Rs是酸位感受器[30]。人类拥有至少25个功能性T2R基因用于对苦味的感受，主要分布于口腔中，它们介导苦味信号的传导[31]。T2Rs是一类糖蛋白，具有形成同源或异源低聚体的能力，组合感受不同物质的苦味。据T2Rs识别苦味的物质的广度，它们可分为广谱受体、窄谱受体、平均受体和特定受体[32]。它们共同识别人类摄入物质的苦味，刺激异源三聚体G蛋白解离，产生亚基可促进Ca2+释放，导致Na+通过Trpm5通道内流，打开CALHM1 通道释放ATP，激活味觉传入神经通路[33-35]。Wong等[36]人的研究结果表明，谷胱甘肽是苦味信号转导的主要介质。

2008年，Kenji等[37]发现，Gly-Phe、Gly-Leu等苦味二肽以及许多其他苦味化合物能激活hT2R1，这表明人类可以利用这些hT2Rs来识别和感知多肽的结构和苦味。之后，Jasbir等[31]人利用合成的T2R1基因和异源表达系统，证明了各种食物蛋白来源和苦味三肽和双肽激活了人苦味受体T2R1，并发现苦味肽结合在T2R1受体上的同一结合口袋内，该配体结合口袋位于细胞外表面附近。

3风味蛋白酶去苦的方法

蛋白质水解产生苦味阻碍了水解产品的推广，因此，如何降低其苦味一直是科学家们关注的焦点。目前，常用的降低或去除苦味的方法有Plastein反应去苦[38]、Mailard反应降低苦味值[39-40]、微生物法脱苦、酶法脱苦等，近年还发展了微胶囊技术[41]、多肽包埋技术[10，42]来降低苦味。本文综述与风味蛋白酶相关的脱苦或降苦技术。风味蛋白酶主要从酶解苦味肽和掩盖苦味两方面来去苦，详细情况如下。

3.1酶解苦味肽

风味蛋白酶脱苦最常用的方法就是酶解苦味肽，破坏其结构，以此除去苦味。风味蛋白酶可分内肽酶和外肽酶，二者协同作用，共同改善蛋白质水解产物的风味。内切酶从肽链内部结构水解肽键。例如，米曲霉中性蛋白酶rNp1，对肽链中P1和P1上有亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等疏水氨基酸有偏好性，水解这类位点处肽键，可水解花生和大豆蛋白质，在一定程度上降低该产物苦味值[43]。在以标准胰岛素B 链为底物时，rNp1在P1和P1上有亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等疏水氨基酸偏好，具体是在HL︱CG，SH︱LV，HL︱VE，AL︱YL，GF︱FY 等位点有较高的酶切活性[43]。

外切酶可从肽链的N端或C端水解出寡肽或氨基酸。从N端水解的肽酶是氨肽酶，从C端水解的肽酶是羧肽酶。目前，被报道可应用于食品的氨肽酶主要有亮氨酰氨肽酶（LAP;EC 3.4.11.1）、脯氨酸特意性氨肽酶（PsP;EC 3.4.X.X ）等。LAP主要水解多肽N-末端的疏水氨基酸，如亮氨酸、精氨酸、蛋氨酸、丙氨酸等，并在水解亮氨酸时显出最高活性。因此，基于多肽产生苦味的机理，LAP可被认为可以用于用N端疏水氨基酸对蛋白质水解物进行脱苦[44]。目前，已经报道了很多从微生物、植物、动物中分离出的LAP，如从裂殖酵母中提纯亮氨酰氨基肽酶yspII（LapyspII）[45]、从马铃薯块茎中提取的LAP[46]和从鲤鱼骨骼肌中提取的鲤鱼亮氨酰氨肽酶（cmLAP）[47]等，都可运用到脱苦技术中。脯氨酸是干酪等蛋白水解产物中主要的致苦氨基酸，因此PsPs在脱苦技术得到广泛应用。该家族成员有脯氨酸氨基肽酶（PAP;EC 3.4.11.5）[48-49]、X-脯氨酰氨基肽酶（APP;EC 3.4.11.9）[50]、X-脯氨酰二肽基氨基肽酶（PepX）[51]、二肽基肽酶IV（DPP IV;EC3.4. 14.5）[52]等，它们都可特异性识别脯氨酸，从苦味肽中特异性水解下脯氨酸或含脯氨酸的二肽或三肽，以此破坏苦味肽结构，达到脱苦效果。在羧肽酶中，主要用于脱苦的是丝氨酸羧肽酶（SCP）。例如，从酿酒酵母中得到的SCP（CPD-Y），在pH 5.5～6.5时，能将大部分氨基酸残基（包括脯氨酸）从蛋白质和多肽的C末端移出[53-54]，对C-末端苯丙氨酸、蛋氨酸和亮氨酸有偏好性[54]。除了酵母之外，还有塞托曲霉、米曲霉、黑曲霉等真菌被发现产生SCP。黑曲霉被报道产两种羧肽酶：CPD-I和CPD-II以N端封闭的氨基酸酯和二肽为底物。CDP-I对疏水氨基酸残基有偏好性，尤其是苯丙氨酸残基;而CPD-II对碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸有高度特异性[54]。

现在，市场上广泛流通的一些商品风味酶，如Novo公司的Flavorzyme、Sigma-Aldrich公司的Protamex，主要是内肽酶和外肽酶的混合物。利用内肽酶先将蛋白质水解，将疏水基团暴露出来，在外肽酶作用下进一步水解，形成游离疏水氨基酸和寡肽，破坏苦味肽结构，降低或去除苦味，改善风味。

3.2提高鲜味掩盖苦味

提高鲜味掩盖苦味是最近几年研究发现的脱苦新方向。蛋白水解物鲜味的产生是因为鲜味肽和鲜味氨基酸的产生。2011年，Rhyu Mee-Ra等[55]鉴定出韩国大酱水提物中的主要致鲜物质是谷氨酸和天冬氨酸，发现分子量在500～1 000 Da的多肽具有较强鲜味。2015年，Kim Min Jung等[56]从大豆水解蛋白中提取鲜味肽，利用hT2R16表达细胞进行Ca2+通量信号转导实验，根据水杨素和鲜味肽混合物的Ca2+通量信号分析来研究鲜味与苦味的相互作用。它们发现鲜位肽可抑制水杨素诱导的细胞内钙内流，这些结果可能提供了鲜味多肽通过苦味受体抑制苦味的证据。这是人们第一次在味觉感受器水平上定义苦味和鲜味之间的相互作用的报道，为酶法去苦提供了新思路。人们可以通过研究如何增加蛋白水解物的鲜度，来抑制苦味信号的传导，从而降低人们对苦味的感知。

4存在的问题及解决方法

在自然界中，人们找到合适的风味蛋白酶存在难度。目前，用于商业推广的有脱苦功能的风味蛋白酶较少，水解位点较单一，并且效果不能很好的满足产品需求。在此基础之上，该酶须符合食品安全标准，才能进行使用。人们可多关注在微生物、线虫、昆虫等培养周期短且容易培养的生物中表达风味蛋白酶，或在这些生物中筛选产风味蛋白酶的种。因为产酶种的培养周期短，在实际应用中，可以提高獲取风味蛋白酶的产量和效率。人们还可以利用生物信息学方法，在已知一些风味蛋白酶编码基因的基础上，在数据库中进行比对，进行初步筛选，找到一些候选基因或物种。

如何增加风味蛋白酶的耐受性和抗逆性，也是推广该酶在食品工业中使用的一个挑战。解决这个问题，一是进行突变，对突变株进行定向筛选;二是研究风味蛋白酶结构，在分子层面，对其进行定向改造。

蛋白酶表达必然依赖宿主的表达系统，因此，宿主的安全性也是重要的考虑因素。宿主需不产毒性物质、不会对环境造成负担。这需要人们在初步筛菌或构建工程菌时就考虑到，对其毒性和对环境的作用进行科学的评估。

5展望

食物蛋白水解物在食品工业中有广泛应用，与人们的生活息息相关。首先，像奶酪[51]、大豆[23]、鱼糜[57]、鱼骨[58]、小麦[21]等在加工过程中，都需要通过蛋白酶作用得到水解产物，再进行进一步加工应用。然而，食物蛋白水解伴随苦味产生。对于动物而言，无论是哺乳动物，还是其他有味觉的动物，拒苦是一种本能，对苦有天然的抗性。因此，对食品或饲料这些入口产品的研究，如何降低或去除苦味是十分重要的问题[29]。

目前，人们对于风味蛋白酶的脱苦研究主要集中在酶水解苦味肽，破坏其结构，获得无苦或苦味值更低的产物。随着大数据时代的来临，生物信息学飞速发展，人们也可用这些方法来解决风味蛋白酶脱苦所面临的问题。

目前，利用风味蛋白酶脱苦的方法已经不局限于酶水解苦味肽，也可以利用鲜味肽的产生，和苦味肽竞争与T2Rs的结合，阻碍苦味信号传导，从而降低人类对苦味的感知程度[59]。因此，除了保持传统的对风味蛋白酶的研究，人们也应重视交叉学科的相互作用，在感官学上研究人类或其他动物感受苦味的机理，再研究对应的风味蛋白酶的作用位点和产物特性。◇

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Research Progress on Flavour Protease for Debittering

ZHAO Pu-ying1，ZENG Xiao-ying1，QIN Rui1，WANG Jing2，XIONG Hai-rong1

（1College of Life Science，South and Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China;2Institute of Food and Nutrition Development，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100081，China）

Abstract：This paper reviewed the bitterness of food protein hydrolysates and the methods of debittering by flavor protease in recent years to provide scientific reference for the development of new flavor protease products.

Keywords：flavor protease;peptidase;bitter peptide;debittering