蛋鸡腺病毒与细菌混合感染的实验室诊断*

简宗辉，孙 帅，闫世雄，黄 英，葛长荣，豆腾飞，贾俊静

(云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201)

云南某蛋鸡场20 周龄罗曼粉商品蛋鸡发生低头缩颈、翅下垂、伏地不起、闭眼昏睡以及排黄绿色稀便等现象，为死亡率高达20%的传染性疾病。临床剖检可见个别鸡腿肌条纹状出血；肝脏灰黄肿大，质脆易碎，有出血斑；腹腔有少量透明淡黄色积液；心包透明淡黄色积液明显，心肌柔软松弛，并伴有心冠脂肪出血；肾稍肿，部分呈花斑状；腺胃乳头充血、出血。临床上多种疾病均可表现上述症状，例如：I 群禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdV)感染造成肝脏受损，引发心包积液，导致心脏衰竭而造成鸡只大量死亡[1]，还能引起以肝炎、肝细胞内形成核内包涵体、贫血和肌肉出血为特征的包涵体肝炎[2]；传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)感染出现胸肌和腿肌条纹状出血，法氏囊出血肿大等临床症状[3-4]；新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)感染引起腺胃乳头出血和心冠脂肪出血；高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza，HPAI) H5N1 感染以各器官出血为特征，且死亡率较高。另外，弯曲杆菌和大肠杆菌感染均能引起肝脏病变，如肝脏肿大、质脆易碎，肝表面有纤维素性渗出物[5]。因此，临床发现上述病理变化的病例时，仅依靠临床及解剖症状对该疾病鉴别诊断极为困难，有必要借助实验室技术对该疾病辅助诊断。

为进一步确定该场病原，本试验无菌采集临床症状明显发病鸡只的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、腺胃、法氏囊和小肠等组织样品。用血琼脂培养基和麦康凯培养基对肝脏和脾脏等组织样品进行细菌分离培养，再通过形态学方法和生化试验鉴定病原菌并进行药敏试验；同时应用PCR/RT-PCR 扩增技术及TA 克隆测序对组织样品进行FAdV、IBDV、NDV 和H5N1 鉴定，以指导临床诊断治疗。

1 材料与方法

1.1 病料采集

病料来源于云南省某暴发疫病的罗曼粉蛋鸡场。随机挑选10 只临床症状明显的发病鸡，颈部放血处死，随后用75%酒精浸泡鸡只5～10 min，采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、腺胃和法氏囊等组织样品，各组织样分别置于消毒后的离心管中，-20 ℃保存备用。采样使用器械每只鸡均进行更换。

1.2 细菌的分离鉴定及药敏试验

将肝脏和脾脏等组织样中加入生理盐水研磨制备组织悬液，取上清后分别涂布在麦康凯培养基和血琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司)表面的角落处，用接种环划线，37 ℃培养24 h，参照GB 4789.6—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》和GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》进行试验。

革兰氏染色：挑取固体培养基上培养24 h的单菌落常规涂片、干燥和固定。滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)染色1 min，水洗；用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1 min，水洗；加75%乙醇脱色30 s，立即水洗；番红复染约2 min，水洗；干燥后用油镜观察并拍照。

药敏试验：将组织悬液上清均匀地涂布在MH 固体培养基(广东环凯微生物科技有限公司)上，待其略干后取阿莫西林、氨苄西林、硫酸粘杆菌素、林可大观霉素、多西环素、卡那霉素、泰乐菌素和安普霉素等8种常用抗生素进行药敏试验。将药敏片轻轻地放在培养基上，置于恒温培养箱中，培养24 h 后观察结果，并测量抑菌圈的大小。抗菌效果判定标准为：≤21 mm 为耐药，≥22 mm 为敏感；敏感质控菌株应在22～29 mm，耐药质控菌株应≤21 mm[6]。

1.3 引物设计

本研究检测所用引物均来自相关文献，由华大基因公司合成。引物信息见表1。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

1.4 病毒核酸的PCR 扩增

参照DNA 提取试剂盒(宝生物工程有限公司)说明书提取病料的基因组DNA，然后通过PCR 方法对组织样本进行FAdV的特异性核酸检测。FAdV 核酸的PCR 扩增反应体系为25 μL：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35 个循环，72 ℃ 延伸10 min。

参照RNA 提取试剂盒(宝生物工程有限公司)说明书提取病料RNA，然后参照反转录试剂盒(宝生物工程有限公司)说明书合成cDNA，再通过PCR 方法对组织样本进行IBDV、H5N1和NDV 特异性核酸检测。IBDV、H5N1 和NDV核酸PCR 扩增反应体系均为25 μL：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：94 ℃5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s (IBDV)/52 ℃ 30 s(H5N1)/45 ℃ 30 s (NDV)，72 ℃ 40 s，共35 个循环，72 ℃延伸10 min。

TA 克隆及测序分析，将PCR 扩增产物经胶回收试剂盒(宝生物工程有限公司)纯化，按连接反应体系将纯化产物与pMD18-T 载体连接。连接体系10 μL：pMD18-T 1 μL，胶回收产物4 μL，SolutionⅠ 5 μL。16 ℃连接2 h，转化。将连接产物10 μL 加到100 mL 大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30 min；42 ℃热应激90 s，立即冰浴2 min，加入600 μL 含Amp的LB 培养基(广东环凯微生物科技有限公司)于37 ℃培养2 h，取100～300 μL 涂LB (Amp+)平板，37 ℃培养过夜。挑取单个白色菌落于LB 液体培养基，37 ℃摇菌过夜培养，再经PCR 扩增鉴定，随后送鉴定成功样品至华大基因公司进行质粒DNA 测序分析。

2 结果与分析

2.1 细菌分离鉴定

组织样品上清液在麦康凯培养基上形成粉红色菌落，乳糖胆盐发酵培养基中显黄色，革兰氏染色呈阴性短杆菌，符合大肠杆菌特征(图1)。血液琼脂培养基上产生溶血，血浆凝固酶试验阳性，革兰氏染色阳性，菌体呈球状，符合金黄色葡萄球菌特征(图2)。血液琼脂培养基上呈中等大小、边缘整齐中央突起的圆形白色、半透明菌落，产生β 溶血圈；革兰氏染色阳性，菌体呈细小杆状，在麦康凯培养基上几乎不生长，符合鸭源鸡杆菌特征(图3)。

图1 大肠杆菌分离培养及鉴定结果Fig.1 Isolation,culture and identification of Escherichia coli

图2 金黄色葡萄球菌分离培养及鉴定结果Fig.2 Isolation,culture and identification of Staphylococcus aureus

图3 鸭源鸡杆菌分离培养及鉴定结果Fig.3 Isolation,culture and identification of Gallibacterium anatis

2.2 药敏试验结果

药敏试验结果(表2)显示：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鸭源鸡杆菌只对硫酸粘杆菌素和多西环素敏感，对氨苄西林、林可大观霉素、卡那霉素和安普霉素均有耐药性。

表2 药敏试验结果Tab.2 Antimicrobial susceptibility test results

2.3 病毒核酸PCR 扩增结果

对病鸡组织样品提取病毒核酸，进行PCR/RT-PCR 扩增。由图4 所示：FAdV 样品扩增条带长约500 bp，与预期片段大小相符；IBDV、H5N1 和NDV 样品结果为阴性，阴性结果未展示。

图4 FAdV 核酸PCR 扩增结果Fig.4 PCR amplification of FAdV nucleic acid

将扩增获得的基因片段与GenBank 中登录的FAdV 全基因序列比对发现：FAdV-D-Yunnan株与FAdV-C-4 毒株同处于一个小分支，亲缘关系最近(图5)，同源性高达100% (图6)。

图5 FAdV-D-Yunnan hexon 基因核苷酸序列系统进化树Fig.5 FAdV-D-Yunnan hexon gene nucleotide sequence phyletic tree

图6 FAdV-D-Yunnan hexon 基因序列同源性Fig.6 Homology of FAdV-D-Yunnan hexon gene sequence

3 讨论

在实际生产过程中，鸡的很多疾病都有相似临床症状和病理解剖特点。因此，仅仅依靠临床症状及病理解剖特点仍不易对疾病进行确诊。本场鸡群临床症状主要为精神萎靡和排黄绿色稀便，并迅速死亡；临床剖解可见胸肌和腿肌有条纹状出血，心包有清亮黄色渗出液，并伴有肝脏、脾脏肿大和腺胃乳头出血等。由于上述临床和解剖特点可由多种病原微生物感染导致，例如：FAdV 感染可引起心包积液和肝脏肿大；IBDV 感染可引起胸和腿肌条纹状出血和腺胃乳头出血，且发病初期法氏囊病变不明显[11]；NDV和H5N1 感染能引起肌胃乳头出血和心冠脂肪出血[12]；葡萄球菌、弯曲杆菌和大肠杆菌等感染均能引起肝、脾和肌胃病变等[13]；与本场发病鸡群的临床症状和病理解剖特点均有相似之处，不易进行鉴别诊断。因此，非常有必要对本场鸡群进行FAdV、IBDV、H5N1 和NDV 病毒核酸检测、细菌分离鉴定及药敏试验，以指导临床诊断和治疗。实验室检测结果显示：该鸡场鸡群主要为FAdV-C-4 病毒感染，同时伴随大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鸭源鸡杆菌继发性混合感染，同时，药敏试验结果显示：3种细菌对多种抗生素具有耐药性，而对硫酸粘杆菌素和多西环素敏感。

FAdV 根据抗原性差异可以分为I、II 和III 群，I 群又可分为A、B、C、D 和E 5 个种，共12 个血清型，能引起鸡包涵体肝炎、心包积液和肌胃糜烂等病变。本试验检出毒株与I 群禽腺病毒FAdV-C-4 毒株同处于1 个小分支，亲缘关系最近，同源性高达100%，即本场鸡群为Ⅰ群禽腺病毒FAdV-C-4 感染。本场鸡群表现的临床症状、病理解剖症状及较高死亡率等特点与MASE 等[14]和CHEN 等[15]的研究结果相符。本病毒一年四季均可发生，死亡率为20%～75%，最高可以达到80%。董振杰[16]将2015—2017 年10 个省送检的455 份疑似感染样品对FAdV 进行病毒核酸PCR 扩增，阳性率分别是60.78%、68.50%和27.14%，结果表明：从2015 年开始该病在国内多地流行，呈现大面积暴发。有调查发现：本病在中国多地均有发生，且各日龄、各品种的鸡只均有感染，病程为1～4 周[17-19]，本试验鸡群发病日龄与之相符。另外，腺病毒是无囊膜病毒，具有较强抵抗力，通过消毒方法杀灭环境中的腺病毒具有一定困难；且病毒感染途径多样化，如孵化、养殖和青年鸡转运等环节都可能造成该病毒感染。因此，本病预防过程中消灭传染源是关键，但难以实现；而长远的防控措施是完善生物安全工作，同时疫苗免疫能有效预防该病发生[20]。因此，全国范围内加速对本病毒主要流行基因型调查和疫苗研发势在必行。本场鸡群为病毒感染为主的细菌性继发混合感染，提示本病的诊疗过程，不能单一考虑禽腺病毒感染，还应该结合实际情况确定是否存在其他病毒和细菌混合感染。然而，随着抗生素在养殖业中的广泛使用，耐药菌的不断出现给细菌感染性疾病的治疗带来了巨大挑战。因此，必须通过药敏试验对抗生素进行辅助选择。药敏试验不仅能对抗生素选择提供理论依据，同时也能指导合理使用抗生素，避免病原菌耐药性产生。本试验检出的3种细菌对氨苄西林、林可大观霉素、卡那霉素和安普霉素等4种抗生素具有耐药性，与CHEN 等[15]、郭京蓉等[21]和李伟娟等[22]的研究结果一致，即葡萄球菌和大肠杆菌对多种抗生素具有多重耐药性。因此，在蛋鸡生产的各个环节中都应加强生物安全工作，同时保持良好的饲养环境，并对鸡群进行本病毒主要流行基因型的免疫，将有助于预防本病的暴发。

4 结论

该鸡场鸡群主要为FAdV-C-4 病毒感染，同时伴随大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鸭源鸡杆菌继发性混合感染，药敏试验结果显示：3种细菌对多种抗生素具有耐药性，但对硫酸粘杆菌素和多西环素敏感。