通过定向进化技术提高角蛋白酶的热稳定性研究

傅 岩 张铁鹰* 孙英霞 李松育

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193；2.山西农业大学动物科学学院，太原 030801)

角蛋白结构稳定、疏水性极强[1-2]，动物内源蛋白酶难以将其有效降解[3]。家禽屠宰副产物羽毛中粗蛋白质含量在90%以上，若能高效利用可有助于缓解我国蛋白质饲料资源供需矛盾。传统物理、化学方法处理角蛋白存在诸多不足，产品氨基酸营养品质差，且易产生环境污染[4-5]。目前，已经发掘出多种角蛋白降解菌，包括细菌[6-9]、真菌[10-12]、放线菌等[13-14]，这些菌株均可分泌能特异性降解角蛋白的蛋白酶——角蛋白酶。角蛋白酶可水解不溶性角蛋白[15-16]，是处理羽毛等角蛋白资源的较优的生物制品[5,17]，可用于处理羽毛，提高其营养价值[18-19]，或直接用作饲料添加剂[20]。

角蛋白热稳定性强，可耐受饲料制粒温度，在高温条件下可提高其酶促反应速率。本实验室前期研究发现，地衣芽孢杆菌CP-16角蛋白酶的热稳定性不佳[15]。因此，改善角蛋白酶热稳定性，对提高其酶解羽毛角蛋白效率和在畜禽饲粮中应用具有重要意义。目前有关角蛋白酶结构与功能的研究报道较少，大多设计均参考同源性较高的其他类型蛋白酶[21]。易错PCR无需了解蛋白酶结构功能关系，可快速建立突变体文库，实现角蛋白酶分子改良[22-23]。因此，本研究拟通过易错PCR构建角蛋白酶突变体文库，以期获得活力高、耐温性好的角蛋白酶突变体，提高其在饲料工业中的适用性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、质粒和培养基

筛选培养基：脱脂奶粉20 g/L，琼脂粉15 g/L，高压灭菌15 min后，加入卡那霉素至终浓度50 μg/mL，制作平板，冷却备用。

发酵培养基：LB液体培养基(50 μg/mL卡那霉素)。

1.2 角蛋白酶突变文库的构建

以含角蛋白酶基因的重组质粒pWB980-K-His为模板，使用特异基因的上游、下游引物对角蛋白酶基因进行易错PCR扩增，使用引物对载体pWB980-K-His进行线性化扩增。

表1 引物序列

参考Zhang等[24]的方法，将纯化后的线性化载体和角蛋白酶基因片段进行延长重叠延伸PCR(POE-PCR)，以实现质粒多聚化。PCR产物转入枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SCK6感受态细胞，稀释涂布于牛奶筛选平板。

1.3 突变体初筛与复筛

为同时获得活性高、热稳定性好的突变体，挑选水解圈与菌落直径比值大于野生型的阳性转化子，摇瓶发酵，检测粗酶液角蛋白酶活性和热稳定性，进行复筛。以100目脱脂羽毛粉(0.5%)为底物，测定经70 ℃热处理5 min后的粗酶液残留酶活性(以未经处理的粗酶液酶活性为100%)。角蛋白酶活性测定参考王德山[15]的方法。

1.4 野生型和突变型角蛋白酶的纯化

以复筛后的正向突变菌株为出发菌，制备粗酶液，经超滤浓缩、镍柱纯化获得目的蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证纯化后酶蛋白纯度及分子质量。

1.5 野生型和突变型角蛋白酶的酶学性质研究

真实底物羽毛粉为不溶底物，为保证数据的精准性，酶学性质测定均使用可溶性蛋白-酪蛋白为底物[15]，所有处理均设置3个重复。

分别于不同pH(7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、12.0、13.0)缓冲液体系，55 ℃，测定野生型和突变型角蛋白酶活性，确定适宜pH。以最高酶活性为100%，绘制酶活性随pH变化曲线。所用缓冲体系：Tris-HCL缓冲体系(200 mmol/L，pH 7.0～9.0)，硼砂-氢氧化钠缓冲体系(100 mmol/L，pH 9.5～12.0)，氯化钾-氢氧化钠缓冲体系(pH 13.0)。

在适宜pH和不同反应温度(40、45、50、55、60、65、70、75 ℃)条件下，测定野生型和突变型角蛋白酶活性，确定适宜反应温度，最高的酶活性定义为100%，绘制相对酶活性随反应温度变化曲线。

纯酶液分别在55、65、75、85 ℃下热处理5 min，适宜条件下测定酶活性，以未经处理的酶活性为100%，计算不同温度处理后的酶活性残留率。

配制不同浓度(0.5、0.8、1.0、1.3、1.5、2.0、2.5、5.0、8.0、10.0、12.0 mg/mL)酪蛋白底物溶液，适宜条件下反应10 min，测定酶活性。利用双倒数法作图，计算动力学参数。

1.6 野生型和突变型角蛋白酶晶体结构模型构建与分析

运用SWISS-MODEL[24]和Discovery Studio Visualizer 4.0对野生型和突变型角蛋白酶晶体进行同源建模及三维结构分析。

2 结 果

2.1 突变型角蛋白酶初筛与复筛

经易错PCR成功构建出角蛋白酶突变体文库(图1)，在牛奶平板挑选水解圈与菌落直径比值不小于野生型的转化子共564株进行摇瓶发酵，测定角蛋白酶的热处理后残留酶活性，获得3株正向突变体。由表2可知，角蛋白酶突变体A307V/S346T、R70G、N245K热处理后残留酶活性分别为72.12%、86.12%、74.82%，均高于野生型角蛋白酶(50.32%)。

图1 阳性转化子在牛奶平板上产生的水解圈

2.2 野生型和突变型角蛋白酶纯化后酶蛋白SDS-PAGE分析

野生型和突变型角蛋白酶纯化后酶蛋白的SDS-PAGE分析结果见图2，目的蛋白条带分子质量与预期一致，单一、无杂带，可用于下一步分析。

2.3 野生型和突变型角蛋白酶酶学性质分析

经不同pH条件下蛋白酶活性测定分析，野生型角蛋白酶和角蛋白酶突变体A307V/S346T适宜pH为10，角蛋白酶突变体R70G、N245K适宜pH为11(图3)。这说明突变位点影响了其适宜pH。

不同温度条件下，角蛋白酶突变体A307V/S346T、R70G、N245K适宜反应温度相较野生型发生偏移(图4)；同时，角蛋白酶突变体A307V/S346T、R70G、N245K的热稳定性也相应提升(表3)。这说明突变位点均影响了其适宜反应温度和热稳定性。

表2 野生型与突变型角蛋白酶发酵液酶活性及热处理后残留酶活性

M：中分子质量蛋白 marker；1：野生型 wild-type；2：突变体A307V/S346T mutant A307V/S346T；3：突变体R70G mutant R70G；4：突变体N245K mutant N245K。

图3 野生型与突变型角蛋白酶适宜pH

图4 野生型与突变型角蛋白酶适宜反应温度

2.4 野生型和突变型角蛋白酶动力学参数

采用双倒数法作图计算角蛋白酶动力学参数，与野生型角蛋白酶相比，角蛋白酶突变体A307V/S346T、R70G、N245K对底物的亲和力与催化效率均有所提升(表4)。

2.5 野生型和突变型角蛋白酶晶体结构模型构建及分析

角蛋白酶突变体A307V/S346T、N245K的突变位点位于成熟肽区域，直接以成熟肽氨基酸序列建模，以地衣芽孢杆菌的枯草菌溶素(PDB蛋白质数据库ID:3unxA)为模板得到野生型角蛋白酶和角蛋白酶突变体A307V/S346T、N245K晶体的三维结构模型图(图5)。角蛋白酶突变体R70G的突变位点位于前导肽区域，用前导肽与成熟肽氨基酸序列建模，以枯草蛋白酶E(PDB蛋白质数据库 ID:3whi.1.A)为模板进行同源建模得到野生型角蛋白酶和角蛋白酶突变型R70G前导肽的三维结构模型图(图6)。角蛋白酶突变体A307V/S346T、N245K、R70G突变位点分析如图7所示。据结构模型显示，3种突变型角蛋白酶突变前后的蛋白质结构均无明显变化。

表3 野生型与突变型角蛋白酶5 min热处理后残留酶活性

表4 野生型与突变型角蛋白酶动力学参数

3 讨 论

本试验利用易错PCR方法，对角蛋白酶进行定向进化，获得了3株耐温性较好的角蛋白酶突变体A307V/S346T，R70G、N245K，反映出易错PCR在酶分子改造方面具有较好的便捷性。初筛所选转化子水解圈均不小于野生型，但角蛋白酶突变体A307V/S346T、R70G的粗酶液角蛋白酶活性为野生型角蛋白酶的89%左右，仅角蛋白酶突变体N245K的发酵液酶活性相对野生型角蛋白酶提升了19.43%，这说明水解圈与发酵酶活性水平间存在不一致性，复筛十分必要。

图5 野生型角蛋白酶(a)和角蛋白酶突变体A307V/S346T(b)、N245K(c)晶体的三维结构模拟示意图

图6 野生型角蛋白酶(a)和角蛋白酶突变体R70G(b)前导肽的三级结构模拟示意图

Val：缬氨酸 valine；Thr：苏氨酸 threonine；Lys：赖氨酸 lysine；Glu：谷氨酸 glutamate；Gly：甘氨酸 glycine。

野生型角蛋白酶与3个突变型角蛋白酶在pH 8～12的缓冲体系中酶活性变化趋势平稳。角蛋白酶突变体R70G、N245K的适宜pH后移至11，在pH 12表现出比野生型更高的相对活性，在碱性pH宽泛性增加，利于在碱性条件下快速处理羽毛角蛋白，在洗涤与纺织业也有较好利用前景。但在畜禽小肠pH(6.0～7.0)条件下，野生型和突变型角蛋白酶活性均大幅降低，影响其作用发挥，后续研究需进一步通过定向进化、C端截短、结构域重组等分子改造手段提高其pH稳定性[21-22]。

根据纯化酶蛋白热处理后酶活性残留情况可见，部分突变型角蛋白酶出现75 ℃组活性高于65 ℃组的现象，这可能与在特定条件下出现蛋白酶自溶现象有关[25-26]。与此同时还发现，纯酶热稳定性明显低于粗酶液，可能是粗酶液中细菌代谢产生的蛋白与角蛋白酶结合暂时形成酶-底物复合物[27]，构象相对稳定。以上现象产生的原因与机制尚需进一步深入研究。

本研究共获得4个角蛋白酶突变位点。角蛋白酶突变体A307V/S346T的307位的丙氨酸(Ala)位于2个β折叠之间的loop区域，Ala的构象不稳定，被替换为缬氨酸(Val)后，构象的稳定性和氨基酸的疏水性均有所增强。疏水作用是蛋白质折叠主要驱动力[28-29]，有利于蛋白质三级结构稳定。Val疏水性增强有助于反应区疏水环境的形成，降低结合状态的自由能，有利于底物与酶的结合，促进催化反应进行，这可能是角蛋白酶突变体A307V/S346T在适宜反应温度与热稳定性提升的同时，还保留了较高活性的主要原因。而346位氨基酸丝氨酸(Ser)与苏氨酸(Thr)的结构功能均较为接近，可能不是影响酶学性质改变的主要突变因素。角蛋白酶突变体N245K的245位氨基酸天冬酰胺(Asn)位于α螺旋，Asn在高温下易发生脱酰胺作用，不利于蛋白质的热稳定性，嗜热蛋白中一般含有较少的Asn和谷氨酰胺[30-32]。同时，已有研究揭示增加蛋白质表面负电荷氨基酸可提高酶稳定性[33]，Asn被替换为赖氨酸(Lys)后可能更有利于α螺旋的稳定。Lys在蛋白表面引入负电荷可能通过静电作用力，形成离子键，稳定了蛋白质结构。角蛋白酶突变体R70G的70位氨基酸位于酶前导肽2个β折叠间的loop上，由精氨酸(Arg)变为结构最为简单的甘氨酸(Gly)，侧链仅有1个氢原子，空间位阻小。空间位阻的改变可能对前导肽结构起优化作用，并进一步影响成熟肽空间结构，从而提升了突变体的热稳定性。已有研究探明前导肽与脂肪酶的热稳定性相关[34]，但在角蛋白酶的研究中多将前导肽与酶活性进行关联分析，前导肽与蛋白酶稳定性间的关系尚无相关报道，该研究结果或许可为今后耐热蛋白酶理性设计提供新的思路。

4 结 论

本试验通过易错PCR成功对地衣芽胞杆菌CP-16来源的角蛋白酶进行了定向进化，筛选到热稳定性提升的角蛋白酶突变体，拓展了角蛋白酶的适用性，并分析了其热稳性提高的分子基础，为耐热蛋白酶理性设计提供新思路。