青霉菌液体发酵及发酵液效价测定

奚逢源，薛长艳，季芳琴，屈晓璐

[1.台州技师学院（筹），浙江 台州 318001；2.台州职业技术学院，浙江 台州 318000]

青霉素从发现到应用对人类的生命征途起到了巨大的作用[1]。青霉素不是单一的结构，又被称为青霉素G[2]、青霉素钠等。青霉素分为天然青霉素和半合成青霉素，两者的生产方法有着天壤之别。例如青霉素G的生产较为简单，只需要通过培养青霉菌孢子培养物来进行发酵，再提取青霉素精制就可以获得钠盐[3]。半合成青霉素则是通过裂解工艺得到的6APA与多种合成有机酸发生酰化反应而得。青霉素的发酵难以实现在线测量关键变量，所以发酵过程的控制是一个较大的难题。现如今，对青霉素发酵的优化重点就在于如何减轻污染以及对发酵过程中的相关生理特性进行优化，尽量降低发酵成本[4]。在青霉素多年的研究中，其生产工艺也在不断完善[5]。本实验首先对青桔霉进行摇瓶浅层液态发酵生产以获取青霉素，其次对获得的发酵液进行效价测定来观察发酵液中青霉素的抑菌活性[6]。通过简单的实验来学习效价测定的方法和青霉素对微生物的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验菌种

（1）菌种：青桔菌，保藏于台州职业技术学院。

（2）指示菌：金黄色葡萄球菌。

（3）用具及试剂：培养皿（90 mm），试管，锥形瓶 （250.0 mL），移液枪，移液管，无菌水，生理盐水，pH为6.0的磷酸缓冲溶液（PBS），氨苄青霉素钠盐（1 667.00 U/mL）。

1.2 仪器设备

超净台、摇床、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、离心机等。

1.3 培养基

营养琼脂（Nutrient Agar，NA）培养基：牛肉浸膏 3.00 g/L，氯化钠1.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，琼脂20.00 g/L，pH为7.4～7.6。

马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培养基：土豆200.00 g/L，琼脂20.00 g/L，葡萄糖20.00 g/L，纯化水。

种子培养基：葡萄糖5.00 g/L，蔗糖60.00 g/L，玉米淀粉20.00 g/L，碳酸钙5.00 g/L，硫酸铵10.00 g/L，纯化水，pH为6.4。

液体发酵培养基：玉米淀粉0.30 g/L，葡萄糖0.40 g/L，蛋白胨0.04 g/L，KH2PO40.02 g/L，MgSO4·7H2O 0.01 g/L，纯化水。

1.4 实验方法

1.4.1 菌种活化

将在-20 ℃下保藏的青桔霉甘油冻存管放置在室温自然融化，然后在PDA斜面培养基中28 ℃培养6～7 d。

1.4.2 摇瓶种子培养

从生长好的PDA斜面培养基接种到液体种子培养基中，25 ℃条件下 200 r/min振荡培养3 d。

1.4.3 菌种摇瓶发酵培养

将培养3 d的种子液以10%的接种量接种到液体发酵培养基中，25 ℃条件下200 r/min振荡培养5～7 d。

1.4.4 制备金黄色葡萄球菌菌悬液

NA培养基在37 ℃下培养24 h后，用生理盐水清洗菌体，3 000 r/min下离心5 min，去除上清液，洗濯1～2次。稀释成浓度约109个/mL的菌悬液后，在冰箱4 ℃下保存待用。

1.4.5 青霉素标准溶液的配制

（1）青霉素标准母液：称取纯氨苄青霉素钠盐0.06 g，溶解在100.0 mL、0.2 mol/L、pH为6的磷酸盐缓冲溶液中，制成1 000.00 U/mL的青霉素标准工作溶液，冷藏存放。

（2）青霉素标准溶液：按照表1配成不同浓度的青霉素标准溶液。

表1 不同浓度青霉素标准溶液的配制

1.4.6 制备生测平板

在超净工作台上，以琼脂培养基为底，取实验用菌悬液 1.0 mL，加入未凝固（一般细菌48～50 ℃，芽孢菌60 ℃）的NA培养基中，取约20.0 mL NA注入双碟上层，参考剂量和其他剂量点各1皿，重复2次，用灭菌1.0 mL移液枪枪头打孔（4个/皿，间距相等），用陶瓷盖覆盖，放置20～30 min，备用。

1.4.7 滴加抗生素溶液

每孔滴加0.2 mL，注意滴加溶液间隔不可过长，溶液的扩散时间不同会影响测定结果。滴加完毕后，用陶瓷盖覆盖双碟，平稳置于双碟托盘内，双碟叠放不可超过3个，以免受热不均，影响抑菌圈大小，将制好的双碟以水平方向平稳移入37 ℃恒温培养箱培养24 h[7]。

1.4.8 测定抑菌圈的直径大小

用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的直径，以毫米为单位，误差不超过0.1 mm，记录，并以青霉素标准溶液浓度为纵坐标、抑菌圈直径的校正值为横坐标来绘制标准曲线。

1.4.9 发酵液效价的测定

将发酵液离心，取上清液原液进行生测，每个被测样品进行3次重复测试，测定方法同标准曲线的测定[8]。在37 ℃下培养24 h，测量抑菌圈的直径并记录在表中。

1.4.10 发酵液效价的计算

求校正值，校正发酵液的值，检查标准曲线值，即发酵原液的效价（如发酵液经过稀释的效价值×稀释倍数即发酵液原液的效价值）[9]。

2 结果与分析

2.1 青霉素标准曲线绘制

每一稀释度做2次重复实验，首先算出实验组平均抑菌圈直径，其次算出各组100.00 U/mL青霉素抑菌圈直径平均值及8套平皿中100.00 U/mL青霉素抑菌圈直径总平均值，以 100.00 U/mL抑制圈的总平均值来校正各组的100.00 U/mL抑制圈平均值，求得各组的校正数值，最后以各组100.00 U/mL抑制圈的校正数值来校正各单位浓度的抑制圈直径，获得各组抑制圈的校正值。本次实验数据验证和实践总结表明，青霉素浓度越高，抑菌圈直径越大，60.00 U/mL青霉素无抑菌圈，可能是因为浓度太低，起不到抑菌、杀菌的效果。以标准青霉素效价为纵坐标、抑菌圈直径的校正值为横坐标来绘制标准曲线，结果如图1所示。

图1 青霉素标准曲线

2.2 发酵液效价测定

将发酵液离心，取上清液进行生测，做3次重复实验，将青霉素标准测定液（100.00 U/mL）在3套培养皿中抑菌圈的平均值与在曲线上100.00 U/mL抑菌圈的直径相比，求得其校正数值-0.812 5 mm。运用此校正值校正被检发酵液抑菌圈直径，求得其校正值10.217 5 mm，检查标准曲线值，将此校正值在标准曲线上查得被检发酵液青霉素浓度为137.42 U/mL。

3 总结与讨论

研究了青霉素的发酵工艺，学习了发酵液的效价测定，实验数据表明，青霉素能对细菌起到有效杀灭作用[10]。通过斜面菌种制作、种子培养、发酵培养、发酵液预处理，再进行青霉素效价测定，测得抑菌圈大小并判断青霉素对细菌的抑制作用。结果表明，青霉素浓度越高，抑菌作用越好。发酵过程的控制和培养基的配制都至关重要，对发酵工艺的优化在今后的实验中也可深入进行[11]，做到减轻污染、提高效率。在实验中，注意严谨、规范地在超净工作台上操作，避免杂菌的污染导致结果产生误差或实验失败。