叶绿素a测定方法的改进

李伟明

（福建省泉州环境监测中心站，福建 泉州 362000）

叶绿素a是反映水体初级生产力的首要指标，也是评价水体富营养化水平的重要参数[1]。环境保护部[2]发布的《水质 叶绿素a的测定 分光光度法》（HJ 897—2017，下称国标法）在地表水环境监测中应用最广泛，以90.0%丙酮为溶剂研磨提取叶绿素a。该方法过程烦琐、耗时较长，容易因为多次转移样品产生操作误差和受光降解反应影响导致测定结果失真。为了优化叶绿素a的提取过程、提高监测数据的准确性，本研究探讨了叶绿素a的提取方法。

提取叶绿素a的关键在于对细胞壁进行有效的破坏。现代动植物细胞破壁技术主要有超声波法、珠磨法、化学渗透法[3-4]。超声波法和珠磨法被广泛应用于实验样品的研磨与提取，本研究在此基础上改进方法。在实验室中，分别用研磨法和超声波法对泉州市某水库水样的叶绿素a进行多次测定及比较，证实将超声波法和珠磨法应用于叶绿素a的测定是可行的，实验取得了令人满意的结果。

1 实验

1.1 仪器与试剂

（1）仪器：分光光度计（Ⅴ-1800，上海美谱达仪器有限公司），离心机（TDZ5-WS，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），超声仪（杭州飞华环保器材厂），抽滤装置。

（2）试剂：90.0%丙酮，1.0%碳酸镁悬浊液。

1.2 样品采集及处理

使用有机玻璃采水器采集泉州市某水库某断面表层、中层及底层水样，采样体积为1.0 L，转移至1.0 L配有磨口塞的棕色玻璃瓶中，每升样品加1 mL碳酸镁悬浊液，以防止酸化引起色素波长偏移，同时套上黑色布袋避光保存。

1.3 国标法制备试样

准确量取500 mL混匀水样，用0.45 μm玻璃纤维滤膜进行抽滤，再用少量蒸馏水清洗滤器壁，在样品刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镊子取下滤膜，将有样品的一面对折，用滤纸吸干滤膜水分。将样品滤膜置于研钵中，加入3～4 mL 90.0%丙酮，研磨至糊状，补加3～4 mL 90.0%丙酮继续研磨。保证充分研磨5 min以上，将完全破碎的细胞提取液转移至10 mL具塞刻度离心管中，用丙酮冲洗研钵和研磨杵，一并转移至离心管中，定容至10 mL。混匀后于4 ℃下避光浸泡提取2.0 h，在浸泡过程中颠倒混匀3次。用离心机以4 000 r/min离心10 min，用针式过滤器过滤上清液得到丙酮提取液（试样），待测。

1.4 珠磨法制备试样

准确量取500 mL混匀水样，用0.45 μm玻璃纤维滤膜进行抽滤，再用少量蒸馏水清洗滤器壁，在样品刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镊子取下滤膜，将有样品的一面对折，用滤纸吸干滤膜水分。将样品对折后置于15 mL具塞刻度离心管中，用90.0%丙酮溶液定容至10 mL标线后加入3颗不锈钢珠。将离心管置于研磨仪中，在50 Hz的频率下振动研磨 5 min后，于4 ℃下避光浸泡提取2.0 h，在浸泡过程中颠倒混匀3次。用离心机以4 000 r/min离心10 min，用针式过滤器过滤上清液得到丙酮提取液（试样），待测。

1.5 超声波法制备试样

准确量取500 mL混匀水样，用0.45 μm玻璃纤维滤膜进行抽滤，再用少量蒸馏水清洗滤器壁，在样品刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镊子取下滤膜，将有样品的一面对折，用滤纸吸干滤膜水分。将样品对折后置于15 mL具塞刻度离心管中，用90.0%丙酮溶液定容至10 mL标线。将离心管置于50 ℃水浴中，在100 Hz的频率下超声破碎20 min后，于4 ℃下避光浸泡提取2.0 h，在浸泡过程中颠倒混匀3次。用离心机以4 000 r/min离心10 min，用针式过滤器过滤上清液得到丙酮提取液（试样），待测。

1.6 样品的测定

将用不同方法制备的试样移至1 cm比色皿中，以90.0%丙酮溶液为参比溶液，于波长750、664、647、630 nm处测量吸光度[2]。用下式计算叶绿素a的质量浓度。

式中：ρ为试样中叶绿素a的质量浓度，mg/L；A750为试样在750 nm波长下的吸光度；A664为试样在664 nm波长下的吸光度；A647为试样在647 nm波长下的吸光度；A630为试样在 630 nm波长下的吸光度；V为提取液定容后的体积，mL；0.5为本次水库水样的体积，L。

2 实验结果与讨论

2.1 比对实验

采集泉州市某水库同一断面表层、中层及底层水样，分别用国标法、珠磨法及超声波法制备7个试样进行测定分析。通过对3种方法测定结果（见表1）的比对分析发现，测定结果有明显差异，超声波法与珠磨法的测定值明显高于国标法，从相对标准偏差可以看出，超声波法与珠磨法的平行性差异不明显，离散情况优于国标法。

表1 实际水样精密度测定结果

2.2 原因分析

通过验证发现，超声波法与珠磨法的测定值相近且高于国标法，平行性优于国标法。根据同系统专家意见，在实验过程中，由于国标法需要进行2～3次人工研磨，在提取叶绿素a的过程中，每个样品要光照约20 min，叶绿素a容易发生光敏降解反应。查阅相关文献发现，叶绿素a在高温和光照条件下能降解。在15 ℃、正午日照条件下，叶绿素a的降解半衰期为6～7 min，在日光灯照射下为5.5 h，在黑暗处为23 d[5]。此外，按照国标法操作，样品提取液在多次转移过程中容易损失，影响测定结果的准确性和精密度。因此，超声波法及珠磨法的提取过程基本在密闭容器中的黑暗处进行，环境温度控制在室温20 ℃左右，可以有效减少高温及光照对叶绿素a降解的影响，同时不需要对样品提取液进行再次转移，避免了转移造成的样品损失，能保证较高的提取效率。

3 结论

（1）丙酮是低毒物质，主要对中枢神经起麻醉作用，浓度较高时会引起耳鼻等部位的炎症，特别严重的情况下甚至会造成昏迷。相比于国标法，超声波法和珠磨法减少了操作人员和丙酮的接触，保护了操作人员的身体健康，而且实验步骤简单、耗时短，减少了样品转移、研磨不完全和光敏降解反应造成的样品损失，提高了实验的准确性和精确性。

（2）通过不同方法的实验室比对发现，超声波法的相对标准偏差范围在1.8%～3.3%，珠磨法的相对标准偏差范围在1.5%～4.0%，国标法的相对标准偏差范围在4.9%～5.4%，可见超声波法及珠磨法的精密度优于国标法，满足环境监测分析要求，适合在环境监测工作中推广应用。