香花油茶果壳与果壳芯总多酚和鞣花酸含量测定

苏宏伟，谷 瑶，马锦林，杨 漓，李桂珍，甘春雁

（1.广西壮族自治区林业科学研究院 广西特色经济林培育与利用重点实验室，广西南宁 530002；2.广西灵水林化有限公司，广西南宁 530199）

香花油茶（Camellia osmantha）是2012年在广西壮族自治区南宁市发现的油茶新物种，出籽率高，油脂特征较其他油茶品种差异较大[1-3]。据统计，2019年广西香花油茶的种植面积达616 hm2[4]。油茶果壳约占整个茶果鲜重的50%～60%，含有植物单宁、多糖、黄酮和多酚等活性物质，活性物质的含量因油茶品种不同而差异明显[5-7]。油茶果壳提取物因多酚类物质含量较高，具有较强的生物活性，有减肥、降脂、降糖和预防前列腺增生等功效[8-10]。鞣花酸属于多酚类物质，是没食子酸的二聚衍生物，以游离鞣花酸或其衍生物等形式广泛存在于各种软果、坚果的组织中[11]；不同品种果实中的鞣花酸含量差异明显[12]，仙居普通油茶（Camellia oleifera）果的鞣花酸含量为2.062 9 mg/g[13]，黑树莓（Rubus mesogaeus）中的鞣花酸含量高达90 mg/g[11]。采用大孔树脂分离纯化油茶果壳提取物，鞣花酸含量明显提高[13]。研究表明，香花油茶果壳提取物对膀胱癌细胞表现出较强的抑制作用，其中主要作用物质为鞣花酸[14]。目前，油茶果壳的研究主要有总多酚提取和纯化工艺[15-17]等，关于香花油茶果壳和果壳芯的总多酚和鞣花酸含量提取还未见报道。

为了提高香花油茶果壳的综合利用率，本研究以香花油茶为研究对象，通过紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法分别测定果壳和果壳芯的总多酚和鞣花酸含量，计算总多酚中鞣花酸的占比，为香花油茶鞣花酸的纯化提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

2019年11月，随机采集种在广西南宁（NN）、横州（HZ）、田阳（TY）、来宾（LB）等地的5年生香花油茶的成熟果实5～10 个，鲜果经自然晾晒、脱壳，将香花油茶果壳阴干至水份含量15%～20%。油茶果壳芯是指油茶果内分隔油茶籽中间的条状物，一般粘附在果壳上[18]。用粉碎机将果壳和果壳芯分别粉粹至50 目，再用高速粉碎机粉碎至100 目，装入样品袋。果壳样品编号为NNK、HZK、TYK 和LBK，果壳芯样品编号为NNX、HZX、TYX和LBX，备用。

无水乙醇、碳酸钠（Na2CO3）、氢氧化钠（NaOH）、甲醇、二甲基亚砜（DMSO）和磷酸均为AR 级；乙腈为色谱纯；自制高纯水；鞣花酸标准品（HPLC ≥98.0%，四川省维克奇生物科技有限公司）；没食子酸标准品（北京盛世康普化工技术研究院）；福林酚试剂（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器

EGLL - 230B 电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；离心机（L530，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；超声波清洗器（HN10-2500，上海汗诺仪器有限公司）；微型植物粉碎机（FZ102，天津市泰斯特仪器有限公司）；高速万能粉碎机（FW100，天津市泰斯特仪器有限公司）；液相色谱仪（Waters e2695）；TP3200 电子天平；纯水仪（优普，TKA LABUPW12）；UV-1750 紫外分光光度计(日本Shimadzu公司）。

1.3 总多酚检测

1.3.1 没食子酸标准曲线绘制

称取没食子酸标准品0.100 g，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，制成没食子酸母液。移取一定体积母液，配制成浓度为10、20、30、40 和50 μg/mL 没食子酸标准溶液。

分别吸取1 mL 不同浓度的没食子酸标准溶液至10 mL 容量瓶中，加入5 mL 浓度为10%的福林酚溶液，摇匀后静置5 min，用4.5 mL的7.5%Na2CO3溶液定容，静置1 h。用紫外-可见分光光度法[19]在765 nm波长下测定吸光度值。

1.3.2 样品检测

分别称取1.000 g 香花油茶果壳和果壳芯粉末（水份含量15.24%），用50 mL 70%甲醇溶液浸泡，用超声波清洗器在70 ℃下提取30 min。离心过滤后，取上层清液，重复浸提3次，合并清液，在200 mL棕色容量瓶中定容。吸取1 mL浸提液稀释至10 mL，从中吸取1 mL 至10 mL 容量瓶，加入5 mL 浓度为10%的福林酚溶液，摇匀后静置5 min，用4.5 mL 的7.5% Na2CO3溶液定容，静置1 h。在765 nm 波长下测定吸光度值。重复3次，取平均值。

1.4 鞣花酸检测

1.4.1 标准曲线绘制

称取鞣花酸标准品10 mg，添加50%甲醇溶液或DMSO 溶液，采用超声波清洗器辅助溶解，滴入1% NaOH 溶液（或不添加），至鞣花酸全部溶解，用50%甲醇或DMSO 溶液定容至100 mL，制成鞣花酸母液。

移取母液0、0.25、2.50、5.00和12.50 mL至25 mL棕色容量瓶，用50%甲醇溶液定容，配制成浓度为0、1、10、20、50 和100 μg/mL 的标准溶液。采用高效液相色谱在波长254 nm 下进行测定，计算吸收峰面积。色谱柱规格为C18色谱柱，250 mm×4.6 mm（粒径5 μm）；流动相为乙腈+0.2%磷酸（18+82）溶液；流动相流量为1 mL/min；进样量为20 μL；柱温30 ℃。

1.4.2 检测限

采用不同溶剂溶解鞣花酸标准品，多次稀释，进行液相色谱分析，测定鞣花酸标准品的最小检测限（LOD）。LOD 定义为信噪比等于3（S/N=3）时对应的进样浓度。

1.4.3 样品检测

分别称取1.000 g果壳和果壳芯粉末，加入10 mL离心管中，加入50%甲醇溶液，采用超声波清洗器在45 kHz 和55 ℃条件下萃取40 min，冷却至室温后，以3 500 r/min 转速离心15 min，取上层清液，萃取3 次，合并上层清液，至25 mL 容量瓶中定容。在进样检测前，待样品经0.45 μm 超滤膜进行过滤。重复3次，通过检测样品的响应峰面积，计算果壳和果壳芯鞣花酸的平均含量。

1.4.4 加样回收试验

称取已知鞣花酸含量的果壳芯样品6 份，每份1.000 g。分别加入一定量鞣花酸标准品，选用不同溶剂进行浸提，按照1.3.2 方法进行制样，采用1.4.1里的液相色谱条件进行测定，计算回收率。

2 结果与分析

2.1 香花油茶果壳和果壳芯总多酚含量

4 个产地香花油茶果壳的总多酚含量差别不大，南宁含量最高（52.0 mg/g），来宾最低（49.5 mg/g）；果壳芯的总多酚含量差别不大，南宁含量最高（39.9 mg/g），田阳最低（35.7 mg/g）；果壳的总多酚含量高于果壳芯（表1）。以总多酚浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，可知方程为y=0.010 6x+0.002 8。

表1 香花油茶果壳和果壳芯总多酚含量Tab.1 Content of total polyphenol in shell and core of C.osmantha fruit(mg/g)

2.2 香花油茶果壳和果壳芯鞣花酸含量

2.2.1 试验条件选择

以吸收峰面积为纵坐标、鞣花酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。添加50%甲醇溶液，鞣花酸标准品保留时间为19.468～ 19.961 min，R2为0.997 3，检测限为0.138 μg/mL（表2～3）。添加NaOH溶液助溶，鞣花酸标准品保留时间为23.324 ～ 24.114 min，R2为0.999 1，检测限为3.310 μg/mL，当浓度为1 μg/mL时，没有信号峰出现，可能是NaOH 溶液与鞣花酸部分反应，使鞣花酸水解物的信号峰出现，该信号峰与标准样信号峰偏差较大。添加DMSO 溶液，R2为0.999 9，拟合度好，检测限为0.056 μg/mL，样品回收率为97.29%，故选用DMSO 作为溶剂溶解鞣花酸标准品。

表2 不同溶剂下鞣花酸的线性回归方程、相关系数和检测限Tab.2 Regression equations,correlation coefficients and detection limits of ellagic acid in different solvents

表3 鞣花酸在不同溶剂中的加样回收率Tab.3 Recovery rate of ellagic acid in different solvents

2.2.2 样品检测

香花油茶的果壳鞣花酸含量均低于果壳芯，果壳和果壳芯的鞣花酸含量最高分别可达187 和426 μg/g（表4）；田阳的果壳芯鞣花酸在总多酚中的占比最高（1.18%），南宁的最低（1.05%），各组间差异不大。果壳芯鞣花酸在总多酚中的占比约为果壳的3倍。

表4 香花油茶果壳和果壳芯的鞣花酸含量和其在总多酚中的占比Tab.4 Contents of ellagic acid in shell and core of C.osmantha fruit and their relative contents in total polyphenols

续表4 Continued

3 讨论与结论

本研究发现广西4个地点的香花油茶果壳和果壳芯的鞣花酸和总多酚含量受油茶种植地域影响较小。果壳的总多酚含量均高于果壳芯，最高为52.0 mg/g，高于油茶果壳的总多酚含量（46.38 mg/g）[9]。果壳芯的鞣花酸含量明显高于果壳，且果壳芯的鞣花酸占总多酚的比值约为果壳的3倍。根据目前鞣花酸的市场需求，可从果壳芯中提取鞣花酸，进行纯化，提升油茶加工剩余物高值化利用率。

本研究建立香花油茶果壳和果壳芯的鞣花酸定量分析方法，采用高效液相色谱法，选取二甲基亚砜溶剂溶解鞣花酸标准品和待检样品，处理方法简单，稳定性高，为香花油茶果壳高附加值活性成分的提取和分离提供了科学依据。