中药材佛手的指纹图谱建立及在鉴别中的应用

余晓燕，余 艳，陈小燕，王 华

（扬子江药业集团，江苏 泰州 225321）

佛手为芸香科植物佛手的干燥果实[1，2]；属芸香科香橼的一个变种，含挥发油、黄酮类、多糖类等药效组分[3]；用于治疗疏肝理气，和胃止痛，燥湿化痰[1]。用于肝胃气滞，胸胁胀痛，胃脘痞满，食少呕吐，咳嗽痰多等[1,2]。

扬子江药业集团生产的胃苏颗粒中包含8 味中药材，其中就有佛手，主要使用产地为广东、广西佛手，不同的供应商佛手质量参差不齐，单纯依靠经验、外观验收存在风险，而中药指纹图谱是一种综合的、可量化的新型技术鉴定手段[4]，以中药化学成分系统研究为基础，可用于评价中药材的真实性、优良性和稳定性[5]。

本实验室通过查阅相关文献，摸索和建立了HPLC法进行佛手的指纹图谱的研究，经过提取溶剂考察、提取时间考察、溶剂倍量考察、重复性考察、不同人员、仪器等考察比较论证后，为胃苏颗粒产品质量稳定可靠提供检验依据。

1 相关仪器及试剂

1.1 仪器安捷伦1260 型HPLC；色谱工作站（OpenLab Ezchrom）；电子天平（Mettler Toledo XPE205）；超声波清洗仪（KQ500DB）。

1.2 试剂磷酸（国药集团；批号：20190805），甲醇（默克公司；批号：20201020），乙腈（默克公司；批号：JA097030），Milli-Q超纯水。

1.3 对照品橙皮苷对照品（批号：110721-201617）来源于中国食品药品检定研究院。

1.4 供试样品佛手药材见表1，各样品为扬子江药业集团江苏制药股份有限公司中心化验室按照佛手药材检验标准检测合格。将佛手药材打粉过2号筛备用。

表1 佛手药材样品

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 波长的选择 按照“2.3 供试品溶液制备方法”制备佛手供试品溶液[6-8]，用二极管阵列检测器进行全波长扫描，比较各波长下的色谱图，最后确定在283nm 时，响应值高且分离的色谱峰信息量多。

2.1.2 提取溶剂的选择 提取溶剂考察甲醇（浓度分别为100%、80%、60%、40%、20%）、水，超声前称定样品重量，采用功率500W超声波进行超声处理，放冷，再分别称定超声后样品重量，分别用溶剂补足减失重量，摇匀，取适量溶液，离心5min（约3000转/min）；将离心后的溶液采用溶剂过滤器进行过滤，取续滤液即得样品溶液。以柚皮苷峰面积作为提取效率的衡量指标，图谱结果表明，甲醇提取效率高，提取峰较多。

2.1.3 溶剂倍量、提取时间的选择 选择甲醇，提取溶剂倍量考察30ml、50ml、70ml、90ml，提取时间考察20分钟、40分钟、60分钟、80分钟。超声前称定样品重量，采用功率500W超声波进行超声处理，放冷，再分别称定超声后样品重量，分别用溶剂补足减失重量，摇匀，取适量溶液，离心5min（约3000转/min）；将离心后的溶液采用溶剂过滤器进行过滤，取续滤液即得样品溶液。以柚皮苷峰面积作为提取效率的衡量指标，图谱结果表明，50ml甲醇提取，提取效率高，提取峰较多。

2.2 色谱条件色谱柱填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶（推荐使用规格：4.6×250mm×5um）；流动相分别为：流动相A=乙腈，流动相B=0.1%磷酸，按表2 中的规定进行梯度洗脱；检测波长为283nm，柱温为40℃；流速为每分钟1.0ml/min。

表2 梯度洗脱

2.3 供试品溶液的制备取编号为304004-2011015佛手粉末约1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，采用功率500W 超声波进行超声处理60 分钟，放冷，称定超声后样品重量，补足减失重量，摇匀，取适量溶液，离心5min（约4000 转/min）；将离心后的溶液采用溶剂过滤器进行过滤，取续滤液即得样品溶液。

2.4 对照品溶液的制备分别精密称取橙皮苷对照品适量，配成橙皮苷（100ug/ml）溶液。

2.5 参照峰的选择从编号为304004-2011015佛手的含量测定HPLC 图谱中可以发现橙皮苷含量较高。选取橙皮苷峰作为参照峰。

2.6 精密度试验取编号为304004-2011015的佛手粉末，按照“2.3 供试品溶液制备方法”制备成1 份佛手供试品溶液[4]。按照“2.2 色谱条件”分析，连续进样6 次，每次进样10μl。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和峰面积基本一致，RSD 均小于5%，相似度结果均大于0.998，符合指纹图谱的标准要求，仪器精密度良好。

2.7 重现性试验取编号为304004-2011015的佛手粉末，按照“2.3 供试品溶液制备方法”制备成6 份佛手供试品溶液[4]。按照“2.2 色谱条件”分析，分别进样，每次进样10μl。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和峰面积基本一致，RSD 均小于5%，相似度结果均大于0.997，符合指纹图谱的标准要求，仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验取批号304004-2011015的佛手粉末，按照“2.3 供试品溶液制备方法”制备佛手供试品溶液，室温放置，于0，2，4，8，12，24小时进样，按照“2.2 色谱条件”分析。图谱结果表明，各色谱峰的相对保留时间和峰面积基本一致，相对平均偏差均小于5%，相似度结果均大于0.998，符合指纹图谱的标准要求，供试品溶液及对照品溶液稳定性试验在24小时内稳定。

2.9 中间精密度试验

2.9.1 不同日期试验 取批号为304004-2011015的佛手粉末，按照“2.3 供试品溶液制备方法”制备成佛手供试品溶液[4]。按照“2.2 色谱条件”分析，3份样品分别进样，每次进样10μl[4]，连续三天。

2.9.2 不同人员试验 取批号为304004-2011015的佛手粉末，每人按照“2.3 供试品溶液制备方法”制备成佛手供试品溶液[4]。按照“2.2 色谱条件”分析，每人进样3次，每次进样10μl[4]。

2.9.3 不同仪器试验 取批号为304004-2011015的佛手粉末，按照“2.3 供试品溶液制备方法”制备成佛手供试品溶液[4]。按照“2.2 色谱条件”分析，分别在3 台高效液相色谱仪上分析，每次进样10μl[4]。

2.9.4 不同色谱柱试验 取批号为304004-2011015的佛手粉末，按照“2.3 供试品溶液制备方法”制备成佛手供试品溶液[4]。按照“2.2.色谱条件”分析，在同一台仪器上，每根色谱柱进样3 份样品，每次进样10μl。

2.9.5 结论 按照不同日期（D1/D2/D3）、不同人员（P1/P2/P3）、不同色谱柱（C1/C2/C3）、不同仪器（H1/H2/H3）设计4 因素3 水平方案如表3 所示，按排列进行试验。

表3 正交实验因素水平表

图谱结果使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版[5]”软件进行相似度比对，佛手耐用性试验相似度在0.923 至0.999，结果表明不同日期、不同人员、不同色谱柱、不同仪器检验的结果无明显差异，符合指纹图谱的标准要求，方法耐用性良好。

3 结果

精密称定10个批次的待分析佛手粉末，按照“2.3.供试品溶液制备方法”制备佛手供试品溶液，按照“2.2.色谱条件”分析。10 批佛手药材与对照品指纹图谱叠加见图1，图谱结果使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版[5]”软件进行相似度比对，佛手相似度范围0.989至0.999。

图1 10批佛手药材与对照品指纹图谱叠加图