PEG修饰的紫草素纳米结构脂质载体的制备和体外评价

秦欢 ，张兵 ，马喆 ，张瀛 ，张钰坤 ，刘志东

（1.天津中医药大学组分中药国家重点实验室，天津 301617；2.天津中医药大学现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津 301617；3.徐州工程学院食品与生物工程学院，徐州 221008）

乳腺癌已成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤，严重影响了女性的身心健康[1-3]。临床治疗以手术为主，辅助以放化疗、内分泌治疗、靶向治疗等手段[4]。紫草素（SKN）及其衍生物有抗炎[5]、抗病毒[6]、抗免疫[7]等多种功效，通过降低 PI3K、Akt的表达及其磷酸化水平[8-9]，抑制细胞活力，上调乳腺癌MCF-7细胞中凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3和Caspase-9的表达，破坏细胞的凋亡调节平衡，促进MCF-7细胞发生自噬[10-12]，影响肿瘤血管异常增生等多种途径来共同发挥抗肿瘤作用[13]。由于SKN不溶于水，体内吸收存在巨大阻碍，限制了其进一步的开发利用。因此通过制剂学手段提高靶细胞/部位的药物摄取及聚集尤为重要。纳米结构脂质载体（NLC）因膜材中加入了不相容的液体脂质，使纳米粒可以以结晶缺陷型或无定型结构存在[14]，增加了药物的包封率和载药率，存储更加稳定，可实现多途径给药，解决了难溶性药物的给药困境[15]。本研究依据NLC优势，制备了紫草素纳米脂质载体（SKN-NLC），能够显著提高SKN的溶解度，通过聚乙二醇（PEG）修饰来延长药物在体内的循环时间，从而提高SKN的生物利用度，更好地发挥抗肿瘤效果。SKN化学结构式见图1。

图1 SKN化学结构式

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC 20AT型高效液相色谱仪（岛津公司，日本）；RET BS 25型磁力搅拌器（艾卡公司，德国）；X射线衍射仪（布鲁克公司，德国）；SorvallST 16R型台式通用冷冻离心机（赛默飞世尔科技公司，美国）；Nano ZS型激光散射粒径分析仪（马尔文公司，英国）；TECNAI 10透射电子显微镜（飞利浦公司，荷兰）；DSC-204差示扫描量热仪（耐驰公司，德国）；FORMA 3111 CO2恒温培养箱（赛默飞世尔科技公司，美国）；生物安全柜（赛默飞世尔科技公司，美国）；Spark型多功能酶标仪（帝肯公司，瑞士）；GE In Cell Analyzer 2000高内涵细胞成像分析系统（通用电气医疗系统有限公司，中国）；KQ-400KDE型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，中国）；FA 124型万分之一天平（天津亿诺科学技术有限公司，中国）；XP205电子天平（梅特勒托利多公司，瑞士）；Milli-Q超纯水系统（默克密理博公司，美国）。

1.2 药品与试剂 SKN对照品（成都普斯生物科技股份有限公司，批号：82854-37-3，含量>98%）；人乳腺癌细胞MCF-7细胞（中国科学院细胞库）；0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）（赛默飞世尔科技公司，批号：25200-056）；双抗（10 000 U 青霉素+10 000 μg链霉素，赛默飞世尔科技公司，批号：15140-122）；DMEM基础培养基（赛默飞世尔科技公司，批号：2044490）；胎牛血清（上海逍鹏生物，批号：04-001-1ACS）；香豆素-6（伊诺凯科技有限公司，批号：S2137139，含量>98%）；Hoechst33342（赫希斯特公司，批号：B8040）；CCK-8试剂盒（同仁化学研究所）；黑色96孔板（德国葛来娜公司，批号：655090）；96孔板（无锡耐思生物科技股份有限公司，批号：701001-1）；细胞培养瓶（无锡耐思生物科技股份有限公司，批号：707003）；辛酸癸酸三酰甘油（Miglyol812，北京凤礼精求商贸有限责任公司）；大豆磷脂（上海艾伟拓医药科技有限公司，批号：SY-SI-180101）；聚氧乙烯硬脂酸酯（西格玛公司，批号：MKBV6365V）；山嵛酸甘油酯（嘉法狮公司，批号：108833）；三氯甲烷（CHCl3，天津康科德科技有限公司，分析纯，批号：20181101）；无水乙醇（天津市康科德科技有限公司，色谱纯）；超滤离心管（规格50 kDa，默克密理博公司）；乙腈（赛默飞世尔科技公司，色谱纯）；甲酸（化成工业株式会社，分析纯）；甲醇（赛默飞世尔科技公司，色谱纯）；二甲基亚砜（DMSO，西格玛公司，批号：D2650）；0.22μm注射器式微孔滤膜（Millex-GP，默克密理博公司）；去离子水（自制）。

2 方法与结果

2.1 SKN-NLC的制备 采用乳化-固化法制备NLC，将处方量的山嵛酸甘油酯、液体脂质辛酸/癸酸三甘油酯溶于CHCl3中，卵磷脂溶于无水乙醇中，在74～75℃水浴中混合均匀构成油相；将处方量的聚氧乙烯硬脂酸酯溶于去离子水中构成水相，将油相注入水相中，磁力搅拌均匀至澄清，过0.22 μm有机滤膜后置于4℃条件下冷藏固化，即得NLC。同法可制得SKN-NLC和SKN-PEG-NLC。

2.2 含量测定方法

2.2.1 色谱条件色谱柱：Agilent ZorbaxSB-C18（安捷伦公司，美国，4.6 mm×50 mm，5 μm，批号：B11055，S.N.USFA003181）；流动相：乙腈-0.2%甲酸水（75∶25）；检测波长：516 nm；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称定SKN对照品4.90mg，加甲醇定容至10mL，得到浓度为0.49mg/mL的对照品储备液。

2.2.3 标准曲线的制备 取对照品储备液，分别稀释出 245.00、122.50、61.25、30.63、15.31、7.66 μg/mL的溶液，每次进样10 μL，以浓度为横坐标，峰响应值为纵坐标，绘制标准曲线。得到线性回归方程为：Y=10 523X-8 748.9，r2=0.999 9（n=3），结果表明 SKN在7.66～245.00 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.4 专属性考察 分别取SKN对照品溶液、乙腈破乳后的Blank-NLC溶液、SKN-NLC溶液、SKNPEG-NLC溶液，每次进样10μL，记录色谱图。如图2所示，辅料和溶剂对药物测定没有干扰，表明该方法专属性良好。

图2 SKN专属性考察结果

2.2.5 精密度实验 取“2.2.2”项中的对照品储备液，分别以甲醇稀释配制成低（30.63 μg/mL）、中（61.25 μg/mL）、高（122.50 μg/mL）3 个浓度的溶液，按照“2.2.1”项下的色谱条件，1 d内重复进样3次，计算日内精密度（n=3）。连续测定3 d，计算日间精密度。计算得日内RSD分别为0.48%、0.63%、0.90%；日间RSD分别为1.24%、0.76%、1.08%，表明日内、日间精密度较好。

2.2.6 稳定性实验 精密量取SKN-NLC，在0、12、24 h时分别吸取10 μL进样，按照“2.2.1”项下的色谱条件，测定峰面积，计算峰面积的RSD（n=6）。结果RSD为2.63%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性实验 平行制备6份破乳的SKNNLC样品，按“2.2.1”项下色谱条件测定，测得SKN的平均含量为 28.53 μg/mL，RSD 为 1.03%（n=6），表明方法重复性良好。

2.2.8 包封率的测定 按“2.1”项下方法制备SKNNLC样品溶液，取0.3 mL样品加去离子水稀释至3 mL，取2 mL稀释后的溶液置于50 KDa超滤离心管内管中，5 000 r/min，离心半径9 cm，离心20 min，取外管中液体，按照“2.2.1”项下的色谱条件进行SKN含量测定，游离SKN含量记为W游离。从上述SKN-NLC样品溶液中取0.2 mL，加入1.8 mL乙腈超声破乳，5 000 r/min，离心半径9 cm，离心20 min。按照“2.2.1”项下的色谱条件进行SKN含量测定，处方中SKN总含量记为W总。按照下列公式计算包封率，包封率（%）=[（W总-W游离）÷W总]×100%。其中W游离为超滤离心管外管中药物量，W总为加入药物和脂质材料总量。测得SKN-NLC和SKN-PEG-NLC的包封率分别为95%和98%。

2.3 NLC的理化表征

2.3.1 粒径电位测定 取制备的SKN-NLC和SKN-PEG-NLC适量，用去离子水稀释至适宜浓度，室温下用激光粒径测定仪分别测定样品的粒径和Zeta电位。测定3次，取平均值。结果显示，SKNNLC 粒径为（17.69±2.32）nm，多分散指数（PDI）为（0.61±1.41）；Zeta 电位为 [-（8.81±1.39）]mV。SKNPEG-NLC 粒径为（19.68±1.25）nm，PDI为（0.28±0.68）；Zeta电位为[-（20.27±1.27）]mV。见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。

2.3.2 制剂形态观察 取Blank-NLC、SKN-NLC、SKN-PEG-NLC溶液稀释至适宜浓度，滴加在覆盖铜网的碳膜上，使液滴在铜网上呈半球形液面，待自然干燥后，滴入2%磷钨酸溶液染色制片，复染3min，用滤纸沿铜网周围吸干染液，自然干燥后置于透射电子显微镜（TEM）下观察NLC形态并拍照。

各组制剂外观形态见OSID，较为澄清透明，质地均一，空白制剂有淡蓝色乳光。由图3可知，透射电镜下制剂溶液呈圆形小球状，分散均匀，形状规整，大小在20 nm左右。与纳米激光粒径仪测定的结果相吻合。

图3 NLC的透射电镜结果

2.4 差示扫描量热测定 精密称取SKN对照品、Blank-NLC冻干粉、SKN-NLC冻干粉、SKN-PEGNLC冻干粉、物理混合物各5mg，升温速率为10℃/min，扫描范围为30～300℃，氮气流速为30 mL/min，差示扫描量热曲线结果见图4。

图4 NLC的差示扫描量热结果

结果显示，SKN和物理混合物在150℃下显示出SKN的放热特征峰。在200℃有1个明显吸热特征峰，而该峰在Blank-NLC、SKN-NLC和SKNPEG-NLC 中消失。Blank-NLC、SKN-NLC、SKNPEG-NLC和物理混合物在50、180和225℃下显示出3个明显的放热峰，而SKN中并未出现，表明SKN以非晶体形态包裹于NLC中。

2.5 X射线衍射研究 精密称取SKN对照品、Blank-NLC冻干粉、SKN-NLC冻干粉、SKN-PEGNLC冻干粉和物理混合物约50 mg，选用Cu靶/石墨单色器，设定检测条件：电压40 kV，电流200 mA，扫描范围 5°～80°，扫描速度 5°/min，采样时间 1 s，用X射线衍射仪进行测定，结果见图5。

图5 NLC的X射线衍射结果

SKN 和物理混合物在 7.5°、10.0°、14.5°时表现出明显的SKN峰值，而在Blank-NLC、SKN-NLC和SKN-PEG-NLC中该峰值消失。Blank-NLC、SKNNLC、SKN-PEG-NLC 和物理混合物在 20°～25°范围内显示出NLC的特征峰。结果表明SKN以分子分散形式而不是游离形式存在于NLC中，这与差示扫描量热测定的结果一致。

2.6 体外细胞摄取研究

2.6.1 细胞培养 使用10%胎牛血清DMEM培养基，于37℃下外接5%CO2培养箱中培养MCF-7细胞，无菌培养与传代。

2.6.2 SKN的细胞毒性评价 以每孔8 000个细胞的密度将MCF-7细胞接种于96孔板中，培养箱中培养至80%细胞密度后，分别使用浓度为0、1、2、4、5、8、10、15、30μmol/L的SKN溶液处理，采用CCK-8法在450nm下测定细胞活性，计算细胞存活率。得SKN半数抑制浓度（IC50）为 11.05 μmol/L，且细胞的存活率随着SKN给药浓度的增大而降低，具有浓度依赖性。细胞存活率（%）=[（As-Ab）÷（Ac-Ab）]×100%（As为实验孔吸光度，Ab为空白孔吸光度，Ac为对照孔吸光度）。

2.6.3 载体抗肿瘤细胞增殖评价 按“2.6.2”项实验步骤，分别加入 100 μL 浓度为 4、11、15 μmol/L的SKN、SKN-NLC和SKN-PEG-NLC溶液，计算细胞存活率。采用SPSS 22.0进行统计分析，所有实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较时，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett-t法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

SKN在4 μmol/L时各组对MCF-7细胞均无明显毒性，与对照组比较无统计学差异（P＞0.05）。当浓度为11 μmol/L时，SKN-PEG-NLC溶液抗肿瘤效果与SKN溶液组及SKN-NLC溶液组比较，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.001）。当浓度为15μmol/L时，SKN-PEG-NLC溶液抗肿瘤效果与SKN溶液组比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。见图6。

图6 NLC 的细胞毒性结果（±s，n=6）

2.6.4 NLC细胞摄取评价 按“2.6.2”项实验步骤培养MCF-7细胞，避光操作每孔加入1 μg/mL的Hoechst 33342溶液孵育30 min，用常温的磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗细胞2遍。加入稀释好的香豆素-6标记的各组制剂，共孵育4 h。将处理好的96孔板放入细胞高内涵成像仪中，设定染料的激发波长与发射波长进行测定。统计分析方法同“2.6.3”项。

荧光主要分布在细胞核周围，即SKN-NLC被MCF-7细胞摄取后主要存在于细胞质中。制剂组细胞荧光强度明显高于SKN溶液组，表明MCF-7细胞对SKN-NLC的摄取高于溶液组。此外，SKNPEG-NLC溶液的荧光强度高于SKN-NLC溶液组，推测PEG修饰后可增加MCF-7细胞对SKN-NLC的摄取。综上，通过将SKN包载于NLC中，表面进行PEG修饰后可增加MCF-7细胞对制剂的摄取。见图7。

图7 高内涵荧光强度柱状图（A）和高内涵荧光强度（B）细胞摄取结果（±s，n=6）

3 讨论

本研究通过乳化蒸发-低温固化法制备了SKN-NLC，通过透射电镜和马尔文激光粒径分析仪可知，制剂外观圆整，粒径分布均匀，体系稳定。粒径分布和电位是纳米载体质量评价的一个非常重要的指标[16]，本研究以实验室前期考察得到的最佳处方制备出的SKN-NLC粒径为17.69 nm，SKNPEG-NLC粒径为19.68 nm。相较于 SKN-NLC，SKN-PEG-NLC的PDI更小，体系更均一，包封率更高。这种空间稳定材料有望制备出更为理想的SKN-NLC制剂，为体内外SKN递送提供稳定保障[17]。本研究通过差示扫描量热仪对SKN、Blank-NLC、SKN-NLC、SKN-PEG-NLC及物理混合物的吸热峰进行表征研究和比较分析，证明了SKN在NLC中以无定形形式存在，X射线衍射实验也证明了上述结论。由细胞增殖抑制实验可知SKN-PEG-NLC的肿瘤抑制作用大于SKN-NLC和SKN溶液。本研究中选择脂溶性的香豆素-6作为荧光探针来替代SKN制备荧光标记的NLC，通过考察发现香豆素-6浓度为 0.05 μg/mL，Hoechst浓度为 1 μg/mL 时对MCF-7细胞无毒性作用，可以进行后续的细胞摄取实验。本实验综合以上研究结果，通过制备NLC提高了SKN的生物利用度，并初步证明了PEG化的SKN-NLC在体外抑制乳腺癌的优势作用，但SKN进入细胞后的抑瘤机制等仍需进一步研究。