基于网络药理学的健脾祛痰和血方治疗冠心病的分子机制研究*

季康寿 ，杨茗茜 ，季小群 ，陈文娜 ，杨关林

（1.辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110031；2.辽宁中医药大学，沈阳 110847）

心血管疾病已经成为全球首要的死亡原因，动脉硬化是导致心血管疾病最常见的病理过程，动脉粥样硬化的核心事件是动脉内膜的斑块形成。冠状动脉粥样硬化性心脏病具有病死率高和复发率高的特点[1]，目前西医药物研究多集中在单靶点，虽然引入了组学技术，但是随着高额科研经费带来的结果产出率并没有得到提升，中医以整体观念为指导思想，注重人体自身完整性及与社会、自然环境的关联与统一，中药存在多成分、多途径、多靶点相互协同作用的特点，网络药理学采取系统性及预测性研究方法，能够从多分子角度诠释药物作用机制，与中医理论有诸多共性。课题组多中心研究显示健脾祛痰和血方临床治疗冠心病疗效显著，此方的特点体现在“和血”，和血法更注重以药性轻缓之药调和痰之渐。因痰为瘀之渐、瘀为痰之至，从痰瘀的防治理论来讲，在病理产物形成之初即采取祛瘀生新而不伤正的缓和之品，使方药在健脾同时采用性平、微寒而入血之药，使全方性偏柔和。但是具体的分子学机制尚未明确，本文试从网络药理学角度诠释该治法的具体机制。

1 材料与方法

1.1 中药成分检索及靶点预测 将健脾祛痰和血方中的中药分别输入中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）[2]、中医药信息数据库（TCMID）[3-5]、中药潜在药物靶标数据库（TCM-PTD）中，根据药物代谢动力学及药物效应动力学特点，筛选中药有效成分，选择药物口服生物利用度（OB）≥30%和药物相似性（DL）≥0.18的化合物，然后根据chemmapper数据库[6]进行药物的靶点预测。

1.2 冠心病靶点预测 选取Therapeutic Target Database（TTD）、a database of gene-disease associations（disgenet）、human phenotype ontolog（HPO）数据库进行冠心病疾病靶点的检索，取3个数据库的并集，并在Uniprot数据库对疾病的药物基因进行标准化，其中“term”选择“ornganism-homo sapiens AND reviewed Yes”。

1.3 药病共表达基因网络构建 通过上述步骤分别建立了药物有效成分对应的基因数据集及冠心病疾病基因数据集，因药物有效成分与基因之间可能为多对多的关系，所以将疾病基因与药物化合物成分对应的基因分别输入到venny2.1.0版本中，对各自的数据集去掉重复值，然后取两个数据集的交集，即为药物、疾病共表达基因，然后将基因输入到STRING：functional protein association networks数据库中，选择“multiple protein”，物种选择“homo sapiens”，调整阈值为最高，得到蛋白的相互作用PPI网络。

1.4 网络药理学分析 在cytoscape中对网络文件进行无方向性合并，然后根据计算拓扑参数，包括节点度、介数中心性及紧密中心性中位数选定，确定中位数以上的区间范围，确定化合物靶点的紧密性连接。

1.5 生物学过程及基因通路分析 将获得的药物与疾病共表达基因统一输入到cytoscape软件中的“cluego”插件中，物种选择“homo sapines”，分别选取“biological process”进行生物学过程分析，选取Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）基因通路注释，统计学差异选择P＜0.05，最后利用cytoscape建立健脾祛痰和血方的主要成分-靶点-信号通路的网络拓扑图。

2 结果

2.1 方药及疾病共同靶点预测 检查数据库共得到化合物861个，经过限定内容筛选共得到主要化合物103个，经过ChemMapper数据库共筛选出药物靶点108个；冠心病靶点筛选采用TTD、disgenet、HPO数据库，通过并集，采用Uniprot进行标准化并筛除非人基因后共得到980个靶点，将两者进行venny2.1.0交互，得到42个病药共同靶点。见图1。

图1 健脾祛痰和血方疾病-药物成分靶点韦恩图

2.2 共性基因的蛋白互作网络构建 将筛选到的42个药病共性基因输入到string数据库中，“minimum required interation score”选择 0.9，选择“hide disconnected nodes in the network”，共得到节点42个，边44条，平均节点度为2.1。见图2。

图2 共同节点的PPI网络图

2.3 化合物及共同关键靶点网络建立 将共同靶点及化合物输入到cytoscape3.2.7中，进行网络的可视化分析，建立方药靶点共表达网络，共得到145个节点，图见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。筛选节点度、介数中心性以及紧密中心性≥中位数的化合物，得到排名前8位的依次是：光果甘草宁-黄酮类、芒柄花黄素-黄酮类、光果甘草酮-黄酮类、1-methyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[5，6-g]benzofuran-6，10，11-trione、粗毛甘草素 F、甘草宁 G、隐丹参酮II、灌木远志酮A。见表1。

表1 前8位方药化合物

2.4 方药中不同药物靶点可视化 方药中各药物存在明显的共性基因，具有共性基因的药物能发挥协同及共同拮抗作用，通过venny2.1.0图能够直观表达各个基因共性及差异性视图化结果。图见OSID。

2.5 药物基因功能分析 将42个病药共性基因输入到cytoscape可视化软件中，选用cluego插件中“go”功能对药物生物学过程进行分析，主要富集在血管直径调节、神经递质生物合成过程、类固醇激素受体活性、管径通路生物学信息调节、长链脂肪酸合成过程、调节血管内皮生长等生物学过程，另外还有众多基因参与了一氧化氮（NO）生物过程及炎症反应过程，从富集分析生物学过程来看，健脾祛痰和血方能够从神经调控反应、抗炎、抗氧化、扩张血管等途径治疗冠心病（图见OSID）。应用cluego中的KEGG插件分析该方药干预疾病的主要通路，结果显示主要涉及到的通路有VEGF信号通路、CGMP-PKG通路等。见图3。

图3 富集分析中信号通路注释

2.6 建立网络拓扑图 以cytoscape软件构建药物成分-靶点-信号通路共表达的网络拓扑图，见图4。共有59个节点，其中9个药物主要成分，涉及到25个病药共同靶点，关联到25个相关基因通路（见表2），能够阐明药物主要成分、病药共表达基因、信号通路之间的相互作用关系。网络分析中各个属性节点之间的连接度较高，而且特征路径的长度也较短，符合small world network理论观点[7]，通过调整单靶点或多靶点即能完成对整个网络的调控，这也为健脾祛痰和血方能够多靶点治疗冠心病的分子机制研究提供了有力证据。

3 讨论

冠心病的二级预防目前仍然是西医治疗冠心病的基本原则[8]，抗血小板及他汀类药物更是冠心病治疗的基石[9]，但其不良反应有消化道不良反应、出血事件、抗血小板药物抵抗，他汀类药物则会影响肝功能、造成横纹肌溶解等。虽然近几年出现了PCSK9[10]等药物，但是由于其费用较为昂贵，增加了患者的医疗负担。除了以上因素，既往的药物研发均是从单靶点、单途径研究药物对疾病的作用，具有明显的局限性。

中医对胸痹的认识最早在《黄帝内经》中便有记载，认为其属于“胸痹”“厥心痛”范畴，主要病机为心脉痹阻。研究显示，冠心病痰浊证的发生率正呈逐年上升趋势[11-12]。本课题组既往采用多中心、盲法、区组随机、平行对照临床试验设计，对研究者、受试者、药品管理人员、数据采集人员和数据统计分析人员实施盲法。同时采用SAS统计软件，按参加单位病例分配数和随机比例形成随机数字分组表，根据随机数字分组法，将受试者按1∶1比例随机分配到试验组、对照组。予方剂：黄芪10 g，党参10 g，白术 10 g，茯苓 10 g，清半夏 6 g，瓜蒌 10 g，丹参10 g，炙甘草3 g[13]。方中党参、黄芪甘温益气健脾；白术甘温兼苦燥之性，甘温补气，苦燥健脾，协党参增益气健脾之功；茯苓甘淡，与白术相伍，守而不走、走而不守，相辅相成；清半夏与瓜蒌相助为用，化痰散结、宽胸之功显著；丹参性寒而缓，在益气健脾同时能祛瘀生新而不伤正，性平和而走血分，且能避免方中温燥之性偏盛，故称和血之法；炙甘草调和方中诸药，共奏方用之效。以益气健脾、祛痰和血法干预冠心病稳定型心绞痛（脾虚痰浊证）患者疗效显著[13]。但是其具体的分子机制，尚未见相关报道。

药理学结果显示，健脾祛痰和血方能够在神经递质合成过程中发挥作用，本课题组先前的研究结果也证实该方能够降低乙酰胆碱及去甲肾上腺素水平，发挥轴性平衡调节作用；且病药共性基因具有抗炎、抗氧化的作用，该方剂对胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）及低密度脂蛋白（LDL）有明显的调节作用，对炎性因子指标C反应蛋白（CRP）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、血管细胞黏附因子-1（VCAM-1）有明显的抑制作用[13]。虽然未见该方关于其长链脂肪酸合成过程、调节血管内皮生长相关的报道结果，但是脂肪酸合酶是内源性长链脂肪酸的关键酶，脂肪酸合酶能够促进单核巨噬细胞对氧化低密度脂蛋折（OX-LDL）的摄取，促进泡沫细胞的形成[14]，且血管内皮生长因子能够在抗炎、抑制心肌细胞凋亡、促进血管再生等方面改善内皮功能[15]，表明健脾祛痰和血方可能在该方面发挥作用，且富集分析结果显示在血管直径调节、微血管功能改善等方面也有可能发挥作用，为健脾祛痰和血方治疗冠心病提供新的需要验证的生物学过程及基因通路。虽然目前关于该治法的基础研究甚少，但是网络药理学证实该方药能够从多靶点、多途径治疗冠心病。由于以上研究是多个数据通过交叉、富集化分析的结果，途径、通路及靶点情况仍需进一步实验结果进行验证。