RIOK2与食管鳞状细胞癌根治术后患者预后的关系

王 雯 蒲 育 赵东利

食管鳞状细胞癌(ESCC)是生物学上具有侵袭性的恶性肿瘤之一，患者的预后较差，5年生存率为15%～25%[1]。近年来，虽然ESCC的临床诊断及综合治疗取得了一定进展，但是患者预后的改善程度仍较低。因此，探究预测效能较高的指标以评估ESCC患者的预后情况具有重要意义，有助于临床医师制定个性化的治疗方案。

右开放阅读框激酶2(RIOK2)是RIO家族成员之一，参与了rRNA的前处理及核糖体的生物合成[2-3]。有研究报道，RIOK2可参与神经胶质瘤、非小细胞肺癌的发病及进展过程，并可反映患者的预后情况[4-5]；RIOK2可被miR-145调控，参与非小细胞肺癌细胞的迁移、侵袭过程[6]。已有多项研究表明，miR-145与ESCC的关系密切，并可反映ESCC治疗的疗效[7-10]。基于上述研究，推测RIOK2可能与ESCC患者的预后有关，其有望成为预测ESCC患者预后的重要指标。本研究检测了ESCC患者中RIOK2的表达水平，并分析其与ESCC患者预后情况的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年4月至2015年6月在西安交通大学第一附属医院就诊的218例ESCC患者作为研究对象。参照《中国早期食管癌筛查及内镜诊治专家共识意见(2014年，北京)》[11]诊断ESCC。纳入标准：(1)经活体组织病理检查确诊为ESCC；(2)接受根治性切除术治疗；(3)ESCC组织标本完好，保存于液氮罐中；(4)患者均知情、同意。排除标准：(1)根治性切除术前接受过放射治疗或化学治疗；(2)合并其他恶性肿瘤；(3)严重肝、肾功能不全；(4)感染性疾病史、血液系统疾病或自身免疫性疾病；(5)临床资料不完整。218例ESCC患者中男性140例，女性78例，年龄44～75岁，平均年龄为(58.25±6.07)岁；肿瘤位于胸上段10例，胸中段152例，胸下段56例。本研究经西安交通大学第一附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 信息收集

收集入组患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤位置、肿瘤直径、TNM分期、分化程度等资料。采用电话随访方式了解ESCC患者的预后生存情况，于患者出院后1个月开始随访，每3个月随访1次，随访终点为患者死亡。

1.3 RIOK2表达水平检测

采用蛋白质印迹法检测ESCC组织中RIOK2的表达水平[12]。实验步骤如下：(1)使用RIPA裂解液提取ESCC组织中总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量；(2)10% SDS-PAGE凝胶电泳，电压由80 V增加至120 V，直至溴酚蓝跑出胶面；(3)在300 mA电流下电泳；(4)5%脱脂牛奶室温封闭1 h；(5)加一抗，4 ℃孵育过夜；(6)加二抗，室温孵育2 h；(7)ELC显影。应用ImageJ 1.8.1软件读取胶片，以β-actin作为内参，记录RIOK2的相对表达量。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 ESCC患者的预后情况

对218例ESCC患者进行为期6～60个月的随访，随访时间中位数为37个月，结果显示患者的1年、3年和5年生存率分别为77.06%(168/218)、46.33%(101/218)和38.53%(84/218)。

2.2 RIOK2表达水平检测

根据ESCC患者的5年生存情况将其分为生存组(n=84)和死亡组(n=134)。生存组RIOK2的相对表达量为0.75±0.10，低于死亡组(0.94±0.16)，两组差异有统计学意义(t=10.622，P<0.001)，见图1。

注：A1、A3为死亡组；A2、A4、A5、A6为生存组图1 生存组和死亡组RIOK2的表达水平 A 蛋白质印迹图 B 两组RIOK2的相对表达量比较

2.3 患者的生存情况比较

结果显示，RIOK2预测ESCC患者预后的ROC曲线下面积(AUC)、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.832(95%CI：0.776～0.879)、0.82、78.36%和79.76%(见图2)。以RIOK2预测ESCC患者预后的最佳截断值作为分界点，将218例ESCC患者分为高表达RIOK2组(n=124)和低表达RIOK2组(n=94)。高表达RIOK2组的中位生存时间为24个月，短于低表达RIOK2组(60个月)，两组差异有统计学意义(log-rankχ2=68.916，P<0.001)，见图3。

图2 RIOK2预测ESCC患者预后的ROC曲线

图3 高表达RIOK2组和低表达RIOK2组的生存曲线

2.4 影响ESCC患者预后的危险因素

将ESCC患者的5年生存情况作为因变量，将可能与预后有关的因素，包括年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤位置、肿瘤直径、T分期、N分期、G分期和RIOK2作为自变量，分别纳入Cox单因素回归分析，结果显示性别、肿瘤直径、T分期、N分期、G分期和RIOK2与ESCC患者的预后有关，而年龄、吸烟史、饮酒史和肿瘤位置与ESCC患者的预后无关，见表1。以P≤0.1作为纳入标准，将年龄、性别、饮酒史、肿瘤位置、肿瘤直径、T分期、N分期、G分期和RIOK2纳入Lasso回归分析，结果显示饮酒史、肿瘤位置、肿瘤直径、T分期、N分期、G分期和RIOK2与ESCC患者的预后有关(P<0.05)，见图4、5。将饮酒、肿瘤位置、肿瘤直径、T分期、N分期、G分期和RIOK2纳入Cox多因素回归分析，结果显示T分期、N分期、G分期和RIOK2均是ESCC患者预后的独立危险因素(P<0.05)，见表1。

图4 Lasso回归中最佳lambda判定图

图5 Lasso回归中各自变量的系数

表1 影响ESCC患者预后生存的单因素和多因素Cox比例风险回归分析

3 讨论

ESCC组织中的部分蛋白或基因与患者的预后密切相关。胥凯凯等[13]研究表明，ESCC组织中表皮生长因子受体过表达的患者的预后较差。王璐瑶等[14]的研究表明，Erbin蛋白在ESCC组织中高表达，其表达量越高提示ESCC患者发生预后不良的风险越高。本文主要探究了ESCC组织中RIOK2的表达水平与患者预后的关系。

李娜等[15]的研究表明，ESCC患者的3年、5年生存率分别为45.0%和39.3%。苗晓慧等[16]的研究结果显示，ESCC患者的1年、3年和5年生存率分别为77.3%、51.1%和38.6%。本研究中218例ESCC患者的1年、3年和5年生存率分别为77.06%、46.33%和38.53%，与上述研究结果相似。本研究结果显示，RIOK2在生存组中的表达水平低于死亡组，这提示ESCC组织中RIOK2的表达水平与患者的预后有关。

为进一步阐明RIOK2的表达水平与ESCC患者预后的关系，本文比较了高表达RIOK2组和低表达RIOK2组的生存时间，结果显示高表达RIOK2组的中位生存时间短于低表达RIOK2组，这提示ESCC组织中RIOK2的表达水平与患者的预后生存情况密切相关。本研究结果显示，性别、肿瘤直径、T分期、N分期、G分期和RIOK2与ESCC患者的预后有关。以P≤0.1作为标准，筛选纳入Cox多因素回归分析的相关指标，结果显示有9项指标符合纳入标准，因本研究的样本量偏小，且为了避免部分指标存在共线性关系而影响分析结果，本研究采用Lasso回归分析对影响ESCC患者预后的相关因素进行筛选，并将筛选结果纳入Cox多因素回归分析，结果显示T分期、N分期、G分期和RIOK2均是ESCC患者预后的独立危险因素。黄鑫等[17]的研究表明，ESCC患者的肿瘤分化程度和肿瘤分期均是影响预后的独立危险因素；另有多项研究表明，ESCC患者的T分期、N分期和肿瘤分化程度与预后密切相关[18-22]，与本文的结论相符。

有研究表明，miR-145在ESCC组织中低表达，且与肿瘤的浸润深度有关[7-8]，过表达miR-145可抑制ESCC细胞的增殖和迁移[8-9]；RIOK2可靶向miR-145参与非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭过程[6]。由此推测，RIOK2的表达水平可以反映ESCC细胞的侵袭和迁移能力，进而反映患者的预后情况。

综上所述， ESCC组织中RIOK2的表达水平与患者的预后有关，其表达水平越高提示患者5年生存率越低。本研究尚存在一定不足，如为单中心研究、纳入的样本量偏小等，今后需进一步对RIOK2通过调控miR-145参与ESCC进展的机制进行探究。