MYPT1在肝细胞癌组织中的表达及意义

张化涛 高丽萍 李秀君 杨 勇

肝细胞癌(HCC)是一种常见的恶性肿瘤，患者预后不良的发生率较高，严重威胁着人们的生命健康[1]。有研究报道，HCC是全球恶性肿瘤相关死亡的第3大原因[2]。2018年一项全球范围的调查结果显示，由HCC导致死亡的人数占恶性肿瘤总死亡人数的8.2%左右[3]。现有的预测HCC患者预后的指标存在敏感度较低或特异度较低等不足[4-6]，因此，探寻敏感度和特异度均较高的生物标志物以准确预测HCC患者的预后情况具有重要意义。

研究表明，RhoA/ROCK信号转导通路可通过影响细胞骨架蛋白重构，或者调控细胞血管形成拟态的生成，参与HCC细胞的侵袭、转移过程[7-8]。RhoA/ROCK信号转导通路的主要信号分子包括RhoA、ROCK、肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(MYPT1)和磷酸化MYPT1[9]。由此推测，检测HCC组织中MYPT1的表达水平对于预测HCC患者的预后情况具有一定参考价值。本文探究了MYPT1与HCC患者的临床病理特征及预后的关系，以期为HCC预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年3月至2015年1月在胜利石油管理局临盘医院确诊的113例HCC患者作为研究对象，经手术切除或经皮穿刺获取患者的HCC组织和癌旁组织(距肿瘤病灶边缘>2 cm)，于液氮罐中保存。参照《原发性肝癌规范化诊治专家共识》[10]诊断HCC。纳入标准：(1)接受肝脏活体组织病理检查；(2)确诊为HCC；(3)病理资料完整；(4)签署了知情同意书。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)合并自身免疫性疾病；(3)年龄>70岁；(4)预计生存期<3个月。113例HCC患者中，男性78例，女性35例，年龄47～70岁，平均年龄为(62.10±5.74)岁。本研究经医院医学伦理委员会批准(批件号：201300118)。

1.2 方法

1.2.1 临床数据收集 应用CT检查收集HCC患者的肿瘤数量、肿瘤直径及血管侵犯情况等；应用病理切片检查了解HCC病灶的分化程度；采用ELISA法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平；采用放射免疫法检测甲胎蛋白(AFP)水平。根据HCC患者有无肝性脑病、腹水、总胆红素、白蛋白、凝血酶原时间判定Child-Pugh分级情况，各项分值为1～3分，总分为各项得分之和，5～6分为A级，7～9分为B级，≥10分为C级。

1.2.2 HCC组织中MYPT1水平检测 采用蛋白质印迹法检测HCC及癌旁组织中MYPT1的表达水平。实验步骤如下：首先，加入细胞裂解液裂解肝脏组织细胞，4 ℃下3 500 r/min离心15 min，离心半径为8 cm，采用BCA试剂盒(购自上海吉至生化科技有限公司)进行蛋白定量。然后，依次进行电泳、转膜、封闭，在4 ℃下孵育兔抗人MYPT1抗体(1∶500，购自武汉菲恩生物科技有限公司)过夜，次日室温下孵育二抗(1∶3 000，购自武汉菲恩生物科技有限公司)1 h。最后，应用ChemiDocTMXRS凝胶成像系统(购自美国Bio-Rad公司)成像，并用ImageJ软件分析实验结果。

1.2.3 随访 采用电话方式收集113例HCC患者的5年预后生存情况。于患者出院后1个月开始随访，每月随访1次，随访终点为2020年1月18日或者患者死亡，中位随访时间为47个月。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 MYPT1在HCC组织和癌旁组织中的表达水平

结果显示，MYPT1在HCC组织中的相对表达量为0.44±0.16，低于癌旁组织(1.06±0.16)，两组差异有统计学意义(t=29.927，P<0.001)，见图1。

注：T指HCC组织，N指癌旁组织图1 MYPT1表达的蛋白电泳图

2.2 MYPT1与HCC临床病理特征的关系

如表1所示，MYPT1与HCC患者的年龄、性别、肿瘤数量、分化程度和HBsAg无关(P均>0.05)，而与肿瘤直径、Child-Pugh分级、AFP和血管侵犯有关(P均<0.05)。MYPT1在肿瘤直径≥5 cm、Child-Pugh分级为B级、AFP≥40 μg/L、存在血管侵犯的HCC患者肿瘤组织中的表达水平分别低于肿瘤直径<5 cm、Child-Pugh分级为A级、AFP<40 μg/L、无血管侵犯的患者，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

表1 MYPT1与HCC临床病理特征的关系

2.3 MYPT1预测HCC患者预后的效能

113例HCC患者1年、3年和5年的生存率分别为92.04%(104/113)、85.84%(97/113)和37.17%(42/113)。MYPT1预测HCC患者预后生存的ROC曲线下面积(AUC)为0.895(95%CI：0.824～0.945)，最大约登指数为0.671，最佳截断值为0.39，敏感度为71.83%，特异度为95.24%，见图2。

图2 MYPT1预测HCC患者预后生存的ROC曲线

2.4 MYPT1与HCC患者预后的关系

以MYPT1预测HCC患者预后的最佳截断值将113例HCC患者分为高表达组(MYPT1≥0.39，n=65)和低表达组(MYPT1<0.39，n=48)。高表达组的中位生存时间长于低表达组(60个月比39个月)，两组差异有统计学意义(log-rankχ2=38.025，P<0.001)，见图3。将HCC患者的预后生存情况作为因变量，将可能与HCC患者预后有关的因素，包括年龄、性别、肿瘤数量、肿瘤直径、分化程度、HBsAg、Child-Pugh分级、AFP、MYPT1和血管侵犯作为自变量纳入Cox单因素回归分析，结果显示肿瘤直径、Child-Pugh分级、MYPT1和血管侵犯与HCC患者预后有关(P<0.05)。将Cox单因素回归分析中可能与HCC患者预后有关的因素(P<0.1)，包括性别、肿瘤直径、Child-Pugh分级、MYPT1及血管侵犯作为自变量，将HCC患者的预后生存情况作为因变量纳入Cox多因素回归分析，结果显示血管侵犯是HCC患者预后生存的独立危险因素(P<0.05)，MYPT1是HCC患者预后生存的独立保护因素(P<0.05)，见表2。

图3 MYPT1高表达组和低表达组的预后生存曲线

表2 影响HCC患者预后生存的单因素和多因素Cox比例风险回归分析

3 讨论

MYPT1基因可表达于机体的多种组织中，在平滑肌细胞中的表达水平较高[11-12]。MYPT1在肿瘤进展中发挥着重要作用，可调控细胞周期、侵袭和转移[13]。研究表明，MYPT1在胃癌和前列腺癌组织中的表达水平较低；过表达MYPT1可抑制胃癌细胞增殖和转移，而抑制MYPT1表达可促进人前列腺癌血管生成，并影响患者预后[14-15]。由此推测，检测HCC组织中MYPT1的表达水平可能有助于了解患者的预后情况。

本研究采用蛋白质印迹法检测HCC组织及癌旁组织中MYPT1的表达水平，结果显示MYPT1在HCC组织中的表达水平低于癌旁组织，这提示MYPT1可能参与了HCC的发病及进展过程。本研究结果显示，肿瘤直径≥5 cm、Child-Pugh分级为B级、AFP≥40 μg/L和存在血管侵犯的HCC患者肿瘤组织中MYPT1的表达水平较低，这提示MYPT1可能通过调节HCC患者肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及AFP水平，进而参与HCC的发病和进展，并影响HCC患者的预后生存情况。本研究构建了MYPT1预测HCC患者预后生存情况的ROC曲线，结果显示AUC、敏感度和特异度分别为0.895、71.83%和95.24%，这提示MYPT1预测HCC患者的预后生存情况具有较高效能，但敏感度较低。此外，本研究结果显示，MYPT1高表达组的中位生存时间长于低表达组，进一步表明MYPT1与HCC患者的预后生存关系密切，其表达水平越高提示HCC患者的预后生存期越长。杜培源等[16]研究指出，存在微血管侵犯的HCC患者发生预后不良的风险较高，其是HCC患者术后生存的独立危险因素。本研究采用单因素和多因素Cox比例风险回归模型分析影响HCC患者预后生存的相关因素，结果显示血管侵犯是HCC患者预后生存的独立危险因素，与上述研究结果相符。此外，本研究结果还显示MYPT1是HCC患者预后生存的独立保护因素。

综上所述，MYPT1在HCC组织中低表达，且MYPT1表达水平越低，提示HCC患者预后生存期越短。检测HCC组织中MYPT1的表达水平有助于预测患者的预后生存情况，为临床治疗提供参考。本课题组今后将进一步探究MYPT1参与HCC发病和进展的病理、生理机制。