一株新型鸭呼肠孤病毒山东分离株的分离鉴定与遗传进化分析

李雪松，孙 悦，石晓娜，宿 鑫，闫大为，王思琪，刘金华，李泽君

（1.中国农业大学动物医学院，北京 100193；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

目前，呼肠孤病毒病已成为危害我国水禽养殖业的主要疫病之一，该病毒可以感染番鸭、半番鸭、樱桃谷肉鸭、麻鸭和鹅等水禽。引起水禽发病或者死亡，或者引起继发感染造成更大的经济损失。该病首次在南非报道被发现，1997年传入中国，大多在我国福建、浙江等南方地区鸭群发病传播，是一种以肝脏、脾脏表面有多量白点，肾肿大、出血为主要病理变化的传染病，因其最易感染番鸭，被称之为番鸭呼肠孤病毒病[1]。

2005年开始，在我国广东省、四川省等地发现可感染麻鸭、番鸭、半番鸭和樱桃谷鸭等各种商品鸭的新毒株，后被学者称为鸭呼肠孤病毒，该病毒引起的鸭呼肠孤病毒病死亡率为5%～20%[2-6]。2017年，在我国山东、河南、江苏等地区的养鸭场中暴发了一种以脾脏肿大、出血、坏死为主要特征的新的鸭呼肠孤病毒病，因其致病性不同于先前描述的鸭呼肠孤病毒病，被称为新型鸭呼肠孤病毒病。该病毒对雏鸭的危害特点尤为严重，番鸭、半番鸭的发病日龄主要为6～25日龄，其中以7日龄居多，病程5～7 d；樱桃谷鸭发病日龄主要为10～30日龄。新型呼肠孤病毒发病率为5%～32.5%，病死率达4%～20%[7-10]。

2018年8月初，山东省某肉鸭场1日龄的樱桃谷雏鸭出现了一种以雏鸭脾坏死为主要特征的疫病，初期鸭只精神萎靡、食欲降低，发病后很快出现急性传播感染并引发较高死淘率。本研究从临床采集发病鸭的肝脏、脾脏等组织病料中分离到1株病毒，并对分离到的病毒株进行PCR鉴定和测序分析，确定该毒株为新型鸭呼肠孤病毒。

1 材料与方法

1.1 样品来源 山东省某肉鸭场送检的疑似新型鸭呼肠孤病毒感染的樱桃谷肉鸭。

1.2 主要材料与试剂 GreenTaqTMMix和2× AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2 （Probe qPCR）试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；病毒RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；SPF鸭胚购自中国农业科学院上海兽医研究所。根据GenBank中已有的DRV S1基因序列，利用Oligo软件设计合成了一对DRV特异性引物，扩增目的基因大小为566 bp，其他鸭常见疫病扩增引物为本实验室保存，鸭呼肠孤病毒荧光定量PCR上游引物EF为5'-CGCCTGATACTTTCCCTCCT-3'，下游引物ER为5'-TAAGTCCTGCCACCTGTGAG-3'，探针EP为FAM-ATCAAATCCCTCCAAAGCGCTAMRA，扩增片段总长为199 bp。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 病料的剖检及样品处理 剖检观察患病雏鸭脏器的病理变化，并取病变明显的病鸭肝脏。剪碎后以1∶4的比例加入含1000 U/mL双抗的PBS，研磨后于-40℃反复冻融3次，4℃、7000×g离心l0 min，取上清液无菌过滤后备用。

1.4 常见鸭病毒传染病检测 用实验室禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、1型鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A Virus type 1，DHAV-1）、3型鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A Virus type 3，DHAV-3）、鸭呼肠孤病毒（Duck reovirus，DRV）、鸭星状病毒（Duck astrovirus，DAstV）、鸭细小病毒（Duckling parvovirusis，DPV）、鸭瘟病毒（Duck enteritis virus，DEV）、鸭圆环病毒（Duck circovirus，DuCV）和鸭腺病毒（Duck adenovirus，DAdV）的引物，对1.3处理好的样品进行PCR或RT-PCR，确定引起该病的病原体。

1.5 病毒分离和检测 上述1.2脾脏和肝脏样品经尿囊腔各接种12日龄SPF鸭胚5枚，0.2 mL/枚。置于37℃孵育，每12 h照胚1次，观察7 d。弃除24 h内死亡的鸭胚，对24 h后死亡的鸭胚进行解剖，观察病变。收取死亡鸭胚的尿囊液、尿囊膜和胚体，其中尿囊膜和胚体以1∶10的比例加入10倍双抗PBS后研磨。-20℃反复冻融3次，4℃、10 000×g离心10 min，取上清液后备用，将其命名为SDHZ。并利用实验室建立的NDRV定量RT-PCR方法对提取的尿囊液、尿囊膜和胚体对病毒增殖的拷贝数进行检测。

1.6 血凝（Hemagglutination，HA）试验 分别取上述1.5中的上清液SDHZ，按照《中国兽药典》附录中的“血凝（HA）试验”，分别对1%的鸡红细胞悬液进行血凝（HA）试验，观察分离株是否对鸡血红细胞产生凝集现象。

1.7 病毒S1基因扩增 用病毒RNA提取试剂盒提取分离毒SDHZ的RNA，反转录成cDNA，对S1基因进行分段扩增。S1-1F：5'-GCTTTTTT CTTCTCTGCCCAT-3'，S1-1R：5'-TTGTAGATCT GCCACCGTCGA-3'；S1-2F：5'-ACTTTCCCTCC TCCCCTACCA-3'，S1-2R：5'-GATGAATAGCTC TTCTCAT-3'，其中S1-1扩增750 bp，S1-2扩增片段为969 bp。按GreenTaqTMMix试剂说明书进行PCR，取10 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，并送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

1.8 目的基因同源性比对及分析 对SDHZ株S1基因及其编码的Sigma C氨基酸测序结果利用MEGA6和DNAStar软件进行比对分析，绘制系统进化树，并对Sigma C蛋白氨基酸进行同源性分析。

2 结果

2.1 解剖病理和鸭常见病毒性疾病PCR鉴定 患病鸭剖检可见脾脏出现肿大、出血、坏死（图1A），肝脏大面积出血。用AIV、NDV、DHAV-1、DHAV-3、DRV、DAstV、DPV、DEV、DuCV、DAdV的实验室鉴定引物，经PCR或RT-PCR检测结果显示，样品PCR鉴定为DRV阳性，鸭其他主要常见病毒PCR均为阴性（图1B）

图1 临床患病雏鸭剖检脾脏病变（A）和PCR鉴定（B）Fig.1 Spleen lesions (A) and PCR identification (B) of clinical ducklings

2.2 病毒分离 将病料样品离心过滤后，经尿囊腔接种12日龄鸭胚，接种48～120 h后鸭胚开始死亡，死亡鸭胚的病变主要表现为活力减弱，胚体发育不良，水肿和出血（图2）。DRV定量PCR检测收集的鸭胚病毒拷贝数为：鸭胚胚体研磨液（病毒拷贝数为19492）＞鸭胚尿囊液（病毒拷贝数为1108）＞鸭胚尿囊膜（病毒拷贝数为572），将该分离株命名为鸭呼肠孤病毒SDHZ分离株。

图2 病料接种鸭胚的病变Fig.2 Lesion of duck embryo inoculated with the sample

2.3 血凝（HA）试验 对样品进行血凝（HA）试验，检测结果显示该分离株SDHZ对1%鸡血红细胞无血凝活性（图3）。

图3 样品血凝试验测定Fig.3 The hemagglutination test of the clinical sample

2.4 S1基因PCR结果 以病毒分离株SDHZ基因组为模板，提取病毒RNA，经反转录对病毒S1基因进行分段PCR扩增后，经1%琼脂糖电泳分析，得到S1基因约为750 bp和S2基因约为969 bp，与预期结果一致（图4）。

图4 病毒分离株的S1基因分段PCR扩增结果Fig.4 PCR amplification of the isolate S1 gene

2.5 S1基因进化树和sigma C蛋白氨基酸同源性分析 将测序得到的S1基因序列与GenBank中的DRV、MDRV和ARV的参考毒株序列进行进化树分析，分离株SDHZ与我国流行的DRV处于同一分支（图5A），且其sigma C蛋白氨基酸与参考毒株的同源性达到了94.5%～98.7%（图5B）。

图5 鸭呼肠孤病毒SDHZ分离株S1基因核苷酸序列进化树（A）和SigmaC氨基酸同源性（B）Fig.5 Phylogenetic tree analysis based on S1 gene (A) and homology analysis of amino acid of protein Sigma C (B) of DRVs

3 讨论

近几年，在我国肉鸭养殖地区出现一种以脾脏坏死为主要特征的疾病，该病主要造成病患雏鸭精神状态差，饮水和采食量均下降，并伴有脾脏坏死后的机体免疫力下降引起的继发感染，造成更高的死亡率；耐过鸭出现发育受阻、生长缓慢，成为僵鸭，经研究证实新型鸭呼肠孤病毒是造成该病的主要病原[6-8]。该新型鸭呼肠孤病毒病具有发病日龄小、病情发展快、容易快速传播的特点，是以脾脏肿大、出血、坏死为主要临床特征的疾病，给我国养鸭业造成了严重的经济损失[9-10]。

本研究通过SPF鸭胚从病料中分离得到1株DRV山东分离株，进化树和同源性分析发现，分离株SDHZ与我国流行的DRV处于同一分支，且其Sigma C蛋白氨基酸与参考毒株的同源性达到了94.5%～98.7%，是我国流行的DRV分离株，并且通过DRV荧光定量PCR方法发现该病毒感染鸭胚后病毒主要在胚体中增殖，其次是尿囊液和尿囊膜。该病毒主要采用SPF鸭胚进行分离，避免了因为非本源宿主（如鸡胚、LMH细胞或者BHK细胞）对病毒毒力和序列的影响，该研究结果也为今后鸭呼肠孤病毒病疫苗及其防制技术研究提供了理论参考。