高效液相色谱法测定莪术油乳膏含量*

李文静，刘军，李宏铃，包亚男，朱红，洪博

(1.齐齐哈尔医学院药学院，齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省齐齐哈尔市结核病防治院，齐齐哈尔 161006)

莪术油乳膏为齐齐哈尔医学院药学院自制制剂，以莪术油为主要原料药，用于乳腺疾病的防治。李伟泽等[1]报道以莪术二酮和吉马酮为主要活性成分的乳腺康凝胶膏剂治疗乳腺增生疗效显著，且未见不良反应。莪术醇通过下调Bcl-2蛋白表达从而介导抗乳腺癌作用[2]；β-榄香烯经过叶酸修饰被制成纳米脂质体，体内外表现出优异的乳腺癌细胞靶向治疗作用[3]。笔者在本实验以莪术二酮、莪术醇、吉马酮和β-榄香烯为研究对象，建立简便、准确的高效液相色谱法测定莪术油乳膏中4种主要活性成分含量，以期为建立莪术油乳膏质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 鲁能瑞虹高效液相色谱LC-1000D系统(山东鲁能瑞虹化工仪器有限公司，包括四元梯度泵、在线脱气机、柱温箱，紫外检测器等)，安捷伦(Agilent)TC-C18色谱柱(美国安捷伦科技股份有限公司)，JP-500C-8中药材粉碎机(浙江永康市天祺盛世工贸有限公司)，BS124S电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司，感量：0.01 mg)，KQ3200E超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 莪术二酮对照品(批号：111800-201001，含量：98.5%)、莪术醇对照品(批号：100185-200506，含量：98.5%)、吉马酮对照品(批号：111665-201204，含量：98.5%)、β-榄香烯对照品(批号：100268-200401，含量：99.0%)均购自中国食品药品检定研究院。莪术(批号：20150329)药材均购自亳州市国峰药业销售有限公司，产地为安徽亳州，经齐齐哈尔医学院中药研究室郭丽娜教授鉴定为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis的干燥根茎。无水乙醇、磷酸(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司，批号：20160629)，色谱纯甲醇、乙腈(ThermoFisher 科技有限公司，甲醇批号：40203-15309，乙腈批号：30281-27405)，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司，批号：20180521)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：安捷伦(Agilent)TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流动相：乙腈(A)-水(B)溶液梯度洗脱。洗脱程序：0～7 min，80%A；>7～12 min，80%→100% A，每次进样间隔用80%乙腈平衡。检测波长：216 nm，柱温25 ℃，流速：1.0 mL·min-1，进样量10 μL。

2.2贮备液的制备

2.2.1对照品贮备液的制备 分别精密称取各对照品莪术二酮(1)16.2 mg、莪术醇(2)10.8 mg、吉马酮(3)10.4 mg、β-榄香烯(4)26.0 mg于10 mL量瓶，配制成莪术二酮1.62 mg·mL-1、莪术醇1.08 mg·mL-1、吉马酮1.04 mg·mL-1、β-榄香烯2.60 mg·mL-1的混合对照品贮备液。

2.2.2供试品溶液的制备 取莪术油乳膏样品(本实验室自制，取莪术药材10 g粉碎，置索氏提取装置，以水提取，最终得提取液50 mL。取莪术油提取物10 mL，加白凡士林18 g、十六醇28 g、PEG-8蜂蜡18 mL和单硬脂酸甘油酯32 g于研钵，水浴加热至75 ℃熔化，作为油相。另取月桂醇硫酸钠24 g、甘油70 mL和纯化水500 mL，加热至同样温度，作为水相。将水相细流状搅拌条件下加至油相，逐渐加量并研磨，至温度降至 60 ℃时加入主药，继续研磨直至冷却即得，批号：20180213)10 g，置50 mL烧杯，精密加入异丙醇10 mL，加入甲醇40 mL稀释、超声溶解提取20 min，放冷，用甲醇定容至刻度，孔径0.22 μm滤膜滤过，取续滤液10 μL进样。

2.3专属性实验 取莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β-榄香烯混合对照品溶液适量，在上述色谱条件下进样分析，各组分理论塔板数均不低于3500；另准确称取空白乳膏，按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，精密吸取10 μL进样分析。样品中各待测组分与相邻峰分离度均大于1.5，辅料和提取液不干扰测定，该方法专属性良好，色谱图见图1。

2.4标准曲线的绘制与线性范围考察 精密吸取各对照品溶液适量，置量瓶，用甲醇逐级稀释成莪术二酮为0.051～1.62 mg·mL-1、莪术醇为0.034～1.08 mg·mL-1、吉马酮为0.033～1.04 mg·mL-1、β-榄香烯为0.081～2.60 mg·mL-1的系列标准溶液，将制得的4种待测物6个不同浓度混合对照品溶液，按色谱条件项下进样10 μL，连续进样3次取平均值，计算各对照品峰浓度，以浓度为横坐标(X)、峰面积值为纵坐标(Y)，进行线性回归，结果见表1，各组分在其相应浓度范围内线性关系良好(r>0.998 9)。

表1 莪术油乳膏中4种成分标准曲线与线性范围

2.5精密度实验 取同一混合对照品溶液(莪术二酮0.101 mg·mL-1，莪术醇0.068 mg·mL-1，吉马酮0.065 mg·mL-1，β-榄香烯0.162 mg·mL-1)，在上述色谱条件项下测定，连续进样6次，记录4个对照品峰面积，并计算6次峰面积RSD。结果RSD分别为2.15%，1.99%，2.25%，1.87%，结果表明本实验所用仪器精密度良好。

A.空白乳膏；B.4种待测物标准品；C.莪术油乳膏样品；1.莪术二酮，2.莪术醇，3.吉马酮，4.β-榄香烯。

2.6重复性实验 取同一批莪术油乳膏样品6份，每份10 g，精密称定，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，测定4种待测物成分峰面积，外标法计算浓度及其RSD。化合物莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β-榄香烯RSD分别为1.07%，1.04%，1.19%，1.49%，结果表明本实验提取测定方法重复性良好。

2.7稳定性实验 取同一混合对照品溶液(莪术二酮0.101 mg·mL-1，莪术醇0.068 mg·mL-1，吉马酮0.065 mg·mL-1，β-榄香烯0.162 mg·mL-1)，室温放置，按“2.1”项色谱条件进样分析，分别在0，2，4，8，12 h进样10 μL，测定莪术二酮、莪术醇、吉玛酮和β-榄香烯峰面积，RSD分别为0.85%，1.21%，0.91%和1.02%。结果表明4种待测成分的溶液在12 h内稳定性良好。

2.8加样回收率实验 取同一批莪术油乳膏(批号：20180213)6份，每份5 g，精密称定，加入适量4种化合物标准品(相当于样品含量50%，100%，150%)到供试样品，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，并按“2.1”项色谱条件进样分析，记录色谱峰面积并通过外标法计算浓度，计算各待测成分加样回收率及RSD。结果见表2，显示加入4种待测物成分样品的平均加样回收率为93.67%～98.73%，RSD<2.75%，表明本实验方法准确可靠。

表2 莪术油乳膏中4种成分加样回收率实验结果

2.9样品含量测定 取3批莪术油乳膏样品，每批3份，每份样品取10 g，精密称定，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，并按“2.1”项色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，外标法计算各批4种待测物含量，结果见表3。

表3 莪术油乳膏样品含量测定结果

3 讨论

莪术油乳膏作为一种透皮制剂，可以避免肝肠循环，还可直接作用于靶部位，直接给药效果优于口服或其他途径。目前在国内对含中药材成分的乳膏剂尚无统一标准，但以乳化为基本操作工艺的产品必须按一定的标准进行检测。笔者在本实验采用高效液相色谱法测定莪术油乳膏含量，方法简单、稳定，重复性好，处方中基质不干扰测定，测定结果准确可靠，可为建立莪术油乳膏的质量标准奠定基础。实验中进行色谱条件优化，由于本实验待测4种酚酸类成分极性相近，为达到良好分离度。笔者在本实验采用梯度洗脱，结合文献考察不同流动相和检测波长对样品分离效果的影响，有机相采用甲醇-水、乙腈-水加入不同比例磷酸，分别组合挑选最优流动相，经过多次调整洗脱条件，最终确定以乙腈-水溶液系统作为流动相，4个活性成分得到较好地分离，且柱效较高，拖尾现象得到改善。

多年临床试验证实，中药提取液含有挥发油成分的适宜做成乳膏，但乳膏中一些有效成分尚不明确，加上基质影响，乳膏化学成分复杂，给质量控制带来难题。笔者在本实验对莪术油乳膏提取条件进行优化，以待测4个组分提取率为考察指标，考查提取方法、提取溶剂、料液比等因素，因为莪术油有一定挥发性，所以不适合加热提取，最终本实验确定采用甲醇超声提取方法，该方法准确、简单、重现性好。本实验对莪术油乳膏中主要活性成分进行了含量测定，除此之外，笔者还将对乳膏其他特性进行测试，如外观性状、气味、手感、pH值、黏度、皮肤刺激性、稳定性评价实验等。乳膏成分较复杂，运用现代科学手段分析有效成分在机体内的吸收、分布以及代谢，阐释作用机制，是以后研究的主要方向。