氧化应激在骨关节炎中的研究进展

曹燕，李雪萍

(南京医科大学附属南京医院 南京市第一医院康复医学科，南京 210006)

骨关节炎是一种年龄相关的关节退行性疾病，全球范围内骨关节炎患者已超过3亿人[1]。65岁以上人群中骨关节炎的发病率较高，其病理特征包括软骨损伤、滑膜炎症、软骨下骨和关节周围软组织的破坏，并伴有关节功能障碍。软骨损伤是骨关节炎发生发展的主要因素，正常软骨由大量细胞外基质及少量软骨细胞构成，软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型[2]。骨关节炎是一种多因素疾病，其病因包括遗传因素、年龄、创伤、糖尿病、肥胖和代谢综合征[3]。活性氧类(reactive oxygen species，ROS)在软骨细胞中主要由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)产生，生理情况下可以调节软骨细胞凋亡、基因表达及细胞外基质合成和分解，有助于维持软骨稳态[4]。研究表明，ROS的过量积累可引起氧化应激，进而引起软骨细胞受损和软骨基质的降解，促进骨关节炎的发生[5]。现着重阐述氧化应激及其相关信号转导通路在骨关节炎发病机制中的作用，为骨关节炎靶向治疗提供新思路和新方法。

1 氧化应激与ROS

1.2ROS功能 ROS是细胞内信号转导、基因调节等生理过程中重要的信使分子。有研究表明，ROS可以参与激酶、磷酸酶、半胱氨酸蛋白酶和转录因子等生物分子的翻译后修饰[11]。细胞对ROS的反应方式取决于信号的强度、持续时间以及细胞的氧化还原状态等。生理条件下在软骨细胞内主要由NOX产生低浓度ROS，参与细胞内信号调节、维持软骨代谢[12]。过量ROS可以参与促炎细胞因子对骨关节炎发生发展的驱动过程，导致软骨细胞凋亡等[13]。ROS还可以通过激活基质金属蛋白酶破坏软骨基质中的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，抑制基质合成，导致软骨完整性的丧失[14]。持续的内源性ROS积累可导致软骨细胞凋亡、基质降解及氧化还原相关信号转导通路的破坏，在骨关节炎的发生发展中具有重要作用。

1.3抗氧化系统 细胞内清除ROS、保护细胞免受氧化应激损伤的机制称为抗氧化系统。抗氧化系统包括SOD、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物氧化还原酶等酶促抗氧化剂和非酶抗氧化剂[15]。抗氧化系统可以清除ROS，维持细胞内的氧化还原平衡，保护细胞免受氧化损伤。SOD2是一种能够代谢ROS的线粒体酶，软骨细胞中SOD2缺乏可导致细胞内ROS过度积聚，引起氧化损伤[16]。CAT是关键的抗氧化酶之一，通过破坏细胞中的H2O2产生水和氧气，在很大程度上减轻ROS过度产生引起的氧化应激作用。CAT的缺乏或功能障碍被认为与骨关节炎等衰老相关疾病的发生有关[17]。过氧化物氧化还原酶是主要负责还原H2O2的抗氧化蛋白家族，可以保护软骨免受氧化损伤，在软骨中发挥重要的氧化还原平衡作用[18]。

1.4氧化应激 当细胞内ROS的产生超过抗氧化系统对ROS的清除能力时，过量的ROS导致细胞和组织的氧化损伤，称为氧化应激[19]。在细胞水平上，氧化应激导致线粒体DNA和核DNA损伤、脂质过氧化、蛋白质羰基化、端粒缩短以及细胞信号和代谢途径的改变。研究发现，骨关节炎患者软骨细胞中总过氧化物浓度和氧化应激水平升高[20]。除了ROS产生增加外，骨关节炎软骨细胞中抗氧化酶水平下降也可引起氧化应激。Zhuang等[21]研究发现，骨关节炎软骨细胞中SOD、CAT等抗氧化酶水平显著低于正常软骨细胞，表明抗氧化能力不足可能引起软骨损伤，氧化应激在骨关节炎发病机制中起重要作用。

2 氧化应激与骨关节炎的发病机制

氧化应激是骨关节炎发生发展的主要因素之一。在软骨细胞中，氧化应激通过促进细胞凋亡、诱导细胞自噬失衡等机制参与骨关节炎的发病。

2.1氧化应激与软骨细胞凋亡 软骨细胞缺乏自我更新能力，软骨细胞凋亡在骨关节炎发病机制中起重要作用[22]。细胞凋亡是氧化应激期间的主要病理改变之一，ROS可以通过诱导软骨细胞凋亡促进骨关节炎的发生发展。Pan等[23]将暴露于H2O2的软骨细胞用作实验性氧化应激模型，通过磷脂酰丝氨酸-碘化丙啶双染色法发现H2O2可以促进软骨细胞凋亡，应用抗氧化剂可以降低细胞内丙二醛水平、增加SOD表达，且抑制软骨细胞内聚腺苷二磷酸核糖聚合酶、胱天蛋白酶(caspase)等凋亡相关蛋白的表达，表明抑制氧化应激可以减少H2O2诱导的软骨细胞凋亡。Li等[24]研究通过评估H2O2诱导的软骨细胞内ROS水平、诱导型一氧化氮合酶的表达以及软骨细胞内磷脂酰肌醇-3-激酶、磷酸化的丝/苏氨酸蛋白激酶、caspase-9和caspase-3的表达发现，氧化应激可以通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和caspase途径导致软骨细胞凋亡。骨氧还蛋白1是一种巯基二硫键氧化还原酶，可以参与抗氧化、抗凋亡等细胞过程。Sun等[25]研究发现骨氧还蛋白1表达上调可以通过增加环磷酸腺苷反应元件结合蛋白，经血红素加氧酶1途径限制骨关节炎软骨细胞的氧化应激，减少软骨细胞凋亡，为骨关节炎的治疗提供了新方向。

2.2氧化应激与软骨细胞自噬 自噬是一种重要的细胞稳态机制，用于清除细胞内失活的细胞器和大分子，与程序性细胞死亡、氧化应激等生物学过程相关[26]。Goutas等[27]的研究揭示了健康人和骨关节炎患者的软骨细胞对急性氧化损伤的自噬反应的差异，表明氧化应激相关的软骨细胞自噬反应在骨关节炎中具有重要作用。该研究还发现，暴露于氧化应激后，正常软骨细胞中自噬相关基因的信使RNA和蛋白质表达水平最初增加，6～24 h后降至基础水平；而在骨关节炎软骨细胞中，自噬基因的表达即使在24 h后仍保持较高水平，表明其调节自噬的能力减弱。提示氧化应激可能通过引起软骨细胞自噬缺陷导致骨关节炎发生。Tang等[28]使用叔丁基过氧化氢诱导的小鼠软骨细胞和实施内侧半月板失稳术的小鼠作为骨关节炎模型，分别在体内和体外研究自噬诱导剂海藻糖对氧化应激下骨关节炎软骨细胞及软骨的作用。结果发现，海藻糖可以改善氧化应激导致的线粒体膜电位塌陷、ATP水平降低和DNA损伤，自噬抑制剂可以抵消海藻糖对氧化应激诱导的软骨细胞的保护作用。以上结果表明诱导软骨细胞自噬可为骨关节炎的治疗提供新方向。

2.3氧化应激与微RNA(microRNA，miRNA/miR) miRNA是进化上保守的短链非编码RNA亚家族，其序列长度约为22个核苷酸。miRNA可以作为有效的转录后调节因子，是调节疾病和衰老过程中分子机制的潜在靶标[29]。一项对老年人和骨关节炎患者软骨进行的微阵列研究结果显示，多种miRNA在衰老软骨和骨关节炎软骨中的表达水平发生改变[30]。Zou等[31]在体外用IL-1β诱导小鼠软骨细胞，模拟骨关节炎时的病理环境，采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blotting法检测miR-375和Janus激酶2-信号转导及转录激活因子3通路的表达，结果显示与对照组相比，IL-1β诱导的软骨细胞中miR-375显著增加，细胞增殖和SOD水平降低，而软骨降解酶表达上调，细胞外基质成分合成减少。Cheleschi等[32]用miR-34a、miR-181a抑制剂转染氧化应激诱导的骨关节炎软骨细胞，通过实时荧光定量聚合酶链反应检测miRNA、抗氧化酶的表达，结果发现氧化应激诱导的软骨细胞中miR-34a、miR-181a、SOD2和CAT表达增加，抑制miR-34a、miR-181a可以减轻骨关节炎软骨细胞凋亡和氧化损伤。董宝铁等[33]研究发现miR-1286a在骨关节炎软骨组织及碘乙酸诱导的骨关节炎软骨细胞中表达显著升高，抑制miR-1286a可以减轻骨关节炎软骨细胞凋亡和氧化应激损伤。以上研究结果表明，部分miRNA可能通过氧化应激途径参与骨关节炎的发生，近年来miRNA已用于监测骨关节炎的进展，并作为评估软骨修复的工具。

3 氧化应激相关信号转导通路与骨关节炎

氧化应激导致骨关节炎的发病机制与多种氧化还原相关信号转导通路的调节有关，其中涉及核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)通路、核因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)通路、沉默信息调节因子2同源蛋白1(sirtuin 1，SIRT1)通路以及叉头框转录因子O(forkhead box O，FoxO)信号通路。

3.1NF-κB通路与骨关节炎 NF-κB是一种广泛存在于真核生物细胞中的转录激活因子，可以调节与免疫、炎症、应激反应相关的多种基因，在机体的病理生理反应中发挥重要功能[34]。在软骨细胞中，NF-κB是多种炎症因子在细胞内信号转导的共同途径，作为氧化应激的传感器，可以导致软骨代谢异常，促进骨关节炎进展[35]。有研究发现，川芎嗪、白藜芦醇等可以通过抑制NF-κB通路减轻IL-1β诱导的软骨细胞氧化应激和炎症反应，延缓骨关节炎的进展[36-37]。Hu等[38]研究表明，沙克列汀可以通过下调NF-κB通路减少骨关节炎软骨细胞中ROS的产生和增加谷胱甘肽的表达，并且降低基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-13以及解聚蛋白样金属蛋白酶的表达，进而减少氧化应激引起的软骨细胞凋亡和基质降解。以上研究表明，NF-κB通路的调控可能成为骨关节炎治疗的新方法。

3.2Nrf2通路与骨关节炎 Nrf2是调控细胞内氧化还原反应和信号转导的关键转录因子，在减少细胞内氧化应激损伤、延缓细胞衰老和预防衰老相关疾病等方面发挥重要作用[39]。Nrf2能够调节参与应激反应的基因表达水平，并且参与CAT、SOD等抗氧化酶的合成[40]。Khan等[41]研究发现，与正常软骨相比，骨关节炎软骨中Nrf2及其靶基因的表达显著升高。Nrf2过表达可以激活胞外信号调节激酶1/2信号及其下游靶标，显著抑制IL-1β诱导的软骨细胞中ROS的生成，减轻线粒体功能障碍和软骨细胞凋亡，表明Nrf2激活在骨关节炎中具有抗氧化和抗凋亡功能，并可以通过激活胞外信号调节激酶1/2信号起作用。宋永周等[42]研究发现姜黄素可以通过增强Nrf2表达而降低H2O2诱导的软骨细胞的氧化应激水平。Gao等[43]研究发现锌指家族成员Kruppel样因子2可以通过增强Nrf2的核易位，导致其下游的靶分子血红素加氧酶-1和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸：醌氧化还原酶1的表达增加，进而抑制ROS的产生以减轻IL-1β诱导的软骨细胞凋亡和基质降解。总之，Nrf2通路激活可以降低软骨细胞内ROS的水平，抑制氧化应激过程，从而保护软骨细胞免于氧化应激损伤。

3.3SIRT1途径与骨关节炎 SIRT1是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶，具有调节机体代谢、修复DNA损伤、抵抗应激反应、延缓衰老等作用。SIRT1在骨关节炎中具有抗炎、抗氧化应激和抗凋亡作用，并且可以调节骨稳态、抑制骨关节炎的进展[44]。Feng等[45]用叔丁基过氧化氢刺激的大鼠软骨细胞作为骨关节炎体外模型来研究槲皮素的作用，结果表明槲皮素可以通过激活SIRT1/AMP活化的蛋白激酶信号转导通路减轻氧化应激、内质网应激和软骨细胞凋亡，在动物模型中也证实了其对骨关节炎软骨的保护作用。Feng等[46]进一步研究发现姜黄素通过促进氧化应激诱导的大鼠软骨细胞中SIRT1表达，降低软骨细胞中C/EBP同源蛋白水平并上调软骨保护蛋白Bcl-2的表达，从而抑制氧化应激引起的软骨细胞凋亡，延缓骨关节炎进展。SIRT1是目前研究最充分的沉默信息调节蛋白之一，该家族其他成员是否也有类似作用还需要更多的研究进行证实。综上所述，SIRT1有望成为治疗骨关节炎的重要靶点。

3.4FoxO转录因子与骨关节炎 FoxO家族是一类调节炎症、自噬、衰老等过程的转录因子，其活性与磷酸化状态直接相关。有研究表明FoxO转录因子可以调节软骨细胞的生长、成熟和基质合成，并通过调节氧化应激反应对软骨细胞发挥保护作用[47]。Akasaki等[48]研究发现，FoxO转录因子在老年人和骨关节炎患者的软骨中表达下降且发生磷酸化改变，提示FoxO表达变化可能与软骨退变相关。Akasaki等[49]进一步研究了下调的FoxO转录因子对骨关节炎软骨细胞的影响，用叔丁基过氧化氢处理人关节软骨细胞，并将靶向FoxO1和FoxO3的小干扰RNA转染入软骨细胞中沉默FoxO1和FoxO3的表达，通过噻唑蓝比色法测定细胞活力，检测软骨细胞中凋亡相关的caspase蛋白表达，并评估了CAT等抗氧化酶和SIRT1蛋白表达。结果发现转染后的软骨细胞中凋亡明显增加、细胞活力下降，抗氧化酶和SIRT1水平明显降低。上述结果表明，FoxO转录因子在骨关节炎软骨细胞中具有抗氧化应激、抗凋亡的作用，可为骨关节炎的治疗提供新靶点。

4 小 结

骨关节炎的发生发展受到多种因素的调控，氧化应激在骨关节炎的进展中起重要作用，可通过多种机制促进骨关节炎进展。软骨细胞内ROS过度产生及内源性抗氧化能力不足可引起氧化应激，进一步导致软骨细胞凋亡和软骨基质降解，破坏软骨结构完整性，加重软骨损伤。研究发现NF-κB、Nrf2及SIRT1等氧化应激相关的信号转导通路参与骨关节炎的发生发展。氧化应激影响软骨代谢的机制非常复杂，目前对维持软骨细胞的氧化还原稳态的机制及相关通路仍不明确，需要进一步研究阐明氧化应激与骨关节炎的关系，从多角度深入揭示氧化应激导致骨关节炎的具体机制，为临床上骨关节炎的治疗提供新思路。