陕西省鼠疫耶尔森菌MLVA分型研究

聂守民，罗波艳，孙养信，范锁平，常文辉，王宇萌，孙 杰，安翠红

鼠疫是一种原发于啮齿动物之间并能引起人间流行的烈性传染病，其发病急、传染性强、病死率高，在我国是法定的甲类传染病[1]。在人类历史上，曾发生过3次世界大流行，导致数亿人的死亡。在我国历史上，也曾发生过数次流行，严重危害了人民生命及经济发展。鼠疫也是一种自然疫源性疾病，能够长期在自然界循环传播。按照地理景观、宿主、媒介、鼠疫菌生态型等特点，将我国的鼠疫自然疫源地划分为12种类型[2-3]。榆林市定边县位于陕西省西北部，是陕西、甘肃、宁夏、内蒙古四省(自治区)的交界处。1987年首次被判定为鼠疫自然疫源地，属于内蒙古鄂尔多斯高原长爪沙鼠鼠疫疫源地的一部分。1987-1988年、2000-2001年、2006年分别发生过3次鼠间鼠疫流行，共分离获得66株鼠疫耶尔森菌。

鼠疫耶尔森菌是一种多宿主、多媒介的病原体[4]。鼠疫耶尔森菌的分型包括生物型、生态型及基因型。生物型与生态型由基因型决定，鼠疫耶尔森菌的分型工作对鼠疫预防控制策略的制定及流行病学研究具有重要的指导意义。目前，常用于鼠疫耶尔森菌基因分型的技术主要有差异区段分析(DFR)、规律成簇的间隔短回文重复序列分析(CRISPR)、多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)[5-6]。可变数目串联重复序列(VNTR)是广泛存在于微生物基因组中的以相同或相似的核苷酸序列为重复单位的首尾相连序列[7]，同一物种不同个体的VNTR位点重复数可能不同，这就造成了种内的遗传多态性。MLVA就是通过组合多个位点的VNTR重复数来进行个体鉴定的方法[8]，以PCR为技术基础，结合其他分子生物学研究方法来确定VNTR重复数，从而确定个体的基因型。MLVA主要有分辨能力高、重复性好、操作简便等优点，已广泛应用于鼠疫疫情暴发溯源、鼠疫耶尔森菌种群关系分析。MLVA14+12是最常用的分子分型策略[9]，本研究通过该分型技术对分离自陕西省鼠疫疫源地的66株鼠疫耶尔森菌进行基因分型研究，建立陕西省鼠疫耶尔森菌的多位点VNTR重复数数据库，为今后陕西省鼠疫的监测防治工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株信息 本研究所用的66株鼠疫耶尔森菌均分离自陕西省鼠疫疫源地——榆林市定边县。该疫源地分别于1987—1988年、2000—2001年、2006年发生过3次动物间鼠疫流行。见表1。

表1 陕西省鼠疫耶尔森菌分离株信息Tab.1 Yersinia pestis isolates in Shaanxi Province

1.2 仪器设备 生物安全柜、生化培养箱、PCR扩增仪、高速离心机、瞬时离心机、水平电泳仪、凝胶成像仪、ABI3730测序仪和移液器。

1.3 试剂耗材 核酸提取试剂盒(全式金生物技术有限公司)；超纯水；2×PCR扩增混合液(2×TSINGKE Master Mix，北京擎科生物科技有限公司西安分公司)；琼脂糖；5×TBE电泳缓冲液；上样缓冲液loading buffer；DNA染料；DNA Marker(100 bp Plus DNA Ladder Marker，全式金生物技术有限公司)；96孔PCR板；EP管；不同规格枪头。

1.4 合成引物 参照文献[9]设计MLVA(14+12)引物，合成由北京睿博兴科生物技术有限公司完成，荧光标记的引物注意避光保存，见表2。

表2 26对引物名称及序列信息Tab.2 Primer names and sequence information

表2(续)引物上游引物5′端标记荧光序列(5′-3′)目标长度/bpM22-FFAMGCGTGATACCAAAGGCTGGCTCACC235M22-RGGCACTTTGGGTACGGAACGTCATCACM43-FHEXGAGTGCGCGACGGTATGGTGC269M43-RGCCGCGCATTTATTGATGGTGTCM25-FFAMGTTTAGCTGTAAATAGATTTAGAAGCCTCGTCTTTTGAC335M25-RGATATAAATGAGTTGATTCAGGTGTTCATATTTAACGAAACM23-FHEXGTTAAAACTTAATTAACCAACTTAAGAGTCGCCATATC169M23-RGTTATCAGATTTCGCTTGAAGTAGGTTTAACGATGACM28-FFAMGTTTGGCGGTTGGGCGTACCTTGGTA212M28-RAGCGCCCGTAGACGCTTTCGAAATAGCM29-FHEXGAGCGGCGGGTTCTCATGCTGAT233M29-RGTTTAAGCAGTAGATCTAAAGCGTTATGAATATTGGTGTTA

1.5 核酸提取 本研究所用菌株的核酸提取均在青海省地方病预防控制所完成，采用试剂盒法在P3实验室内进行操作。

1.6 扩增体系及参数 26对引物分成14个反应体系，采用双重或单重PCR方法。单重反应体系总体积为25 μL： 2×PCR扩增混合液12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，超纯水7.5 μL，DNA模板1 μL。双重PCR反应体系总体积25 μL：10 μmol/L上、下游引物各1 μL，其他用量不变。扩增参数：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min；60 ℃(退火温度根据体系有所不同，需要注意)1 min；72 ℃ 1 min；30个循环；72 ℃ 5 min。具体退火温度见表3。

表3 反应体系及各自的退火温度Tab.3 Reaction system and respective annealing temperatures

1.7 PCR结果分析 PCR结束后经水平凝胶电泳确定有无产物及非特异性扩增，通过Marker初步确定PCR产物大小。将PCR产物送北京睿博兴科生物技术有限公司使用ABI3730测序仪进行毛细管电泳，根据电泳得到的产物分子量大小来确定各位点重复数。

1.8 聚类分析 利用BioNumerics(Version7.6)软件，将前14个位点的权重设为2，后12个位点的权重设为1。采用非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析并采用最小生成树(MST)进行高级聚类分析。

2 结 果

2.1 26位点VNTR重复数 陕西省66株鼠疫耶尔森菌分离株基因组中VNTR重复数结果见表4。12个位点(MS56、M15、N2117、N2577、N3773、M33、M34、M22、M43、M23、M25、M28)具有2种及以上的重复数，其他位点只具有1种重复数。M22位点的分辨力最强，重复种数最多(7种)。M22、M34、M28、M15、N3773、N2577、M43位点具有较高的遗传多态性，MS56、M33、M23、M25、N2117位点遗传多态性较低，其他14个位点未出现遗传变异。

表4 陕西省鼠疫耶尔森菌分离菌株的VNTR位点重复结果Tab.4 VNTR site repeat results for Yersinia pestis isolates in Shaanxi Province

2.2 MLVA分群结果 M58、MS56、MS38、M21、M15、M61、MS09、N2486、MS73、MS41、N3779、N2896、N0865、N2976这14个位点是鼠疫耶尔森菌的一级分群指标。陕西省66株鼠疫耶尔森菌分离株经BioNumerics聚类分析后被分成3群：A、B、C群，在MS56位点上有8和9两个重复数，在M15位点上有6、7和8三个重复数，其他位点上只有一种重复数。A群含42株菌，占63.64%，其中只有3株菌为1988年分离，剩余菌株均为2000-2001年分离；B群含16株菌，占24.24%，其中1株菌为1988年分离，剩余菌株均为2006年分离；C群含8株菌，占12.12%，其中2株菌为2000年分离，剩余菌株均为1987-1988年分离。

2.3 MLVA种内分型结果 N1606、N2577、N3773、M34、M33、M22、M43、M25、M23、M28、M29、N2117这12个位点是鼠疫耶尔森菌种内分型指标。经聚类分析，66株鼠疫耶尔森菌基因型分为19种，命名为1-19型。3型、4型、5型、6型、13型、14型、16型、17型为多菌株基因型，其他型为单菌株基因型。其中4型菌株数最多，为22株，占菌株总数的33.33%。1987—1988年分离菌株有7种基因型，2000—2001年分离菌株有12种基因型，2006年分离菌株有2种基因型。有2种基因型(4型、16型)同时出现在1987-1988年、2000-2001年期间。说明鼠疫耶尔森菌基因型发生了变异，并在流行期间逐渐稳定遗传下来(图1、图2)。

图1 陕西省鼠疫耶尔森菌分离株聚类分析Fig.1 Cluster analysis of Yersinia pestis isolates in Shaanxi Province

图2 陕西省鼠疫耶尔森菌分离株最小生成树Fig.2 Minimum spanning tree of Yersinia pestis isolates in Shaanxi Province

3 讨 论

历史上鼠疫曾发生过3次世界大流行，造成数亿人死亡，给全球经济发展及社会稳定造成沉重打击。鼠疫是一种自然疫源性疾病，鼠疫耶尔森菌的保存和世代延续需要具备一种特定的自然生态系统，称为自然疫源地。我国是世界上鼠疫自然疫源地分布最广、结构最为复杂的国家[3]。榆林市定边县是陕西省现存的一块鼠疫自然疫源地，属于内蒙古鄂尔多斯高原长爪沙鼠鼠疫疫源地的一部分。2020年，陕西省邻省内蒙古曾发生人间鼠疫，其病例密接者进入我省，我省高度重视并协助处理。加强鼠疫疫源地动物间鼠疫监测，防止鼠疫的远距离传播是当今鼠疫防控工作的重点。

对引起鼠疫的病原体—鼠疫耶尔森菌进行基因分型是一项很重要的工作，对鼠疫疫情暴发溯源、鼠疫防控策略制定等都具有重大意义。传统的分型技术只能在生物型及生态型方面进行区分，而生物型与生态型是由基因型决定的，所以传统分型技术已经很难满足鼠疫防控工作的需求。随着分子生物学技术的发展，越来越多的基因分型技术应用到鼠疫领域。其中应用广泛、效果最好的技术是MLVA，内含多态性信息，能够通过组合多个位点的VNTR重复数来确定个体的基因型。使用MLVA分型技术，使在区域或全球各级追踪鼠疫耶尔森菌种群的传播途径成为可能[10]。Li等[9]利用MLVA分型方法建立了我国鼠疫耶尔森菌的基因分型数据库，进一步提升了我国鼠疫防控水平；Li等[11]用MLVA分型技术分析了中国、中亚和世界其他地区鼠疫耶尔森菌的关系，为鼠疫的进化研究提供了一种新视角；Oliveira等[12]用MLVA分型技术对巴西的鼠疫耶尔森菌进行了研究，结果表明菌株间存在种内遗传多样性，菌株的遗传种群与菌株的地理和时间来源存在一定的相关性；河北省、云南省、甘肃省等分别采用MLVA分型方法对鼠疫耶尔森菌分离株进行了基因分型，证明了MLVA分型技术在鼠疫耶尔森菌基因分型方面的良好前景[13-15]。

通过对陕西省分离的66株鼠疫耶尔森菌进行MLVA分型，发现3次动物鼠疫流行菌株根据分离时间聚集成为相应群，从最小生成树也可以看出每一次鼠疫流行都有主导基因型鼠疫菌。1987—1988年第一次动物间鼠疫流行，10株菌中有6株分布于C群，3株菌分布于A群，1株菌分布于B群，说明本次流行以C群为主，还有A、B群菌株流行。2000—2001年是第2次流行，41菌鼠疫菌有39株分布在A群中，2株菌分布于C群中，说明本次流行以A群为主，还有C群菌株的流行。2006年的第3次流行，15株菌均分布于B群，说明本次流行鼠疫菌基因型为B群。1987—1988年分离菌株在A、B、C 3个群都有分布，主要在C群，2000—2001年分离菌株在A、C群有分布，主要在A群，2006年分离菌株仅在B群有分布， 3次流行鼠疫菌主导基因型不同，2000—2001年没有检测到B群基因型，但在2006年仅检测到B群基因型，出现这一现象的原因还有待于以后进一步分析。66株鼠疫菌生态型为鄂尔多斯高原生态型菌株[16]，MLVA基因分型分为3群，19种基因型，A群包含12个基因型，B群包含3个基因型，C群包含4个基因型，群内菌株VNTR位点重复数有细微差别，表明MLVA分型方法分辨率极高，可用于观察菌株的微遗传进化。本研究初步建立了陕西省鼠疫耶尔森菌的MLVA基因分型数据库，为今后的鼠疫防控工作提供了科学依据。