河南省部分地区奶牛毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫分子流行病学调查

付 寅，赵洪育，陈远才，李俊强，张龙现

毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoonbieneusi)和芽囊原虫(Blastocystissp.)是2种常见的可引起人和多种动物肠道疾病的重要人兽共患病病原。毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫广泛存在于自然界的肠道寄生虫，主要通过粪口传播，可感染包括人类在内的多种哺乳动物，主要引起腹泻等消化道疾病[1-2]。毕氏肠微孢子虫还可引起宿主角膜炎、心肌炎、脑炎、泌尿系统和呼吸系统疾病[3]，芽囊原虫为引起肠易激综合征的重要病原体[4]。

基于毕氏肠微孢子虫ITS基因型至少可分成11个组(group)，其中group1为主要人兽共患基因型，其余的大部分有其宿主特异性。在牛科动物中发现了超过50种基因型，其中属于group1中的D、Type IV、Peru6、CHN4、EbpA和group2中的基因型J、I、BEB4、BEB6、CHN3、CS-4、EbpC曾在人类中检测到[5-6]。目前公认芽囊原虫有17种亚型(ST1～ST17)，其中ST1～ST9和ST12曾在人类中检出，ST3、ST5、ST6亚型在牛中较为常见[7-8]。

河南省为新兴的奶业大省，近年来更加注重奶业发展，将发展奶业作为农业供给侧结构性改革的重点。截至2020年，河南省奶牛存栏总量达34.2万头，乳产品产量居全国前列。毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫作为奶牛中常见的肠道寄生虫，可造成奶牛生长缓慢和产奶量下降甚至死亡[2-3]。本研究对河南地区奶牛微孢子虫和芽囊原虫的感染情况及基因型分布进行调查，评估河南奶牛微孢子虫和芽囊原虫潜在的人兽共患病传播风险。

1 材料与方法

1.1 样品采集 2019年7月到2020年7月期间，于河南省中牟、荥阳、许昌、原阳、新郑5个行政区的10个奶牛场共采集1 020份奶牛新鲜粪样。为避免交叉污染，每次采样均使用一次性塑料袋收集，并记录采样地点和年龄信息，封存于一次性自封袋中，当天运送到河南农业大学寄生虫实验室，保存于4℃冰箱中待检。

1.2 样品分装和DNA提取 所采集的粪便样品，每份取200 mg转移到1.5 mL离心管中，使用Stool DNA Kit(E.Z.N.A Stool DNA kit, OMEGA)提取粪便中病原的全基因组DNA，按照试剂盒推荐说明书进行操作，获得的DNA保存于—20 ℃冰箱。

1.3 PCR检测 毕氏肠微孢子虫基于ITS基因位点进行巢式PCR检测，引物设计及PCR扩增参考Buckholt等发表的方法[9]。芽囊原虫基于SSU rRNA基因位点进行PCR检测，引物设计及PCR扩增参考Scicluna等发表的方法[10]。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及退火温度见表1。

表1 毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫引物序列Tab.1 Primer sequences for E. bieneusi and Blastocystis sp.

1.4 序列分析与基因型鉴定 阳性PCR产物低温运送至北京诺赛基因有限公司，使用ABIPRISMTM 3730XL DNA测序仪进行双向测序。使用Chormas 2.6(https://chromas.software.informer.com)和MEGA 7.0(https://megasoftware.net)软件对比校正双向测序结果。将校正后的序列于NCBI GenBank(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中进行序列检索以确定毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫的种类及基因型。

1.5 统计学分析 统计学分析使用IBM SPSS Statistics 22软件，采用χ2检验分析不同地区及年龄段奶牛的毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫感染率的差异，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 各地区毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫感染率 对1 020份奶牛粪便样本的DNA进行巢式PCR检测，共检测到221份毕氏肠微孢子虫阳性样品和196个芽囊原虫阳性样品，所有阳性样本均成功测序。通过将获得的阳性样品序列在线Blast同源性比对均在98%～100%。结果显示此次调查检测的微孢子虫和芽囊原虫感染率分别为21.7%(221/1 020)和19.2%(196/1 020)，其中2种病原的混合感染率为3.5%(36/1 020)。

不同地区奶牛毕氏肠微孢子虫的检出率，中牟地区(31.8%,68/214)显著大于荥阳(19.1%,81/424)(χ2=12.758,P<0.01)和新郑(17.3%,19/110)(χ2=7.780,P<0.01)。许昌和原阳地区毕氏肠微孢子虫的检出率分别为22.4%(15/67)和18.5%(38/205)。

不同地区奶牛芽囊原虫检出率，荥阳地区(34.0%，144/424)明显大于中牟(10.3%，22/214)(χ2=41.436，P<0.001)、原阳(1.5%，3/205)(χ2=81.497，P<0.001)、新郑(12.7%，14/110)(χ2=18.904，P<0.001)和许昌(19.4%，13/67)(χ2=5.638，P=0.018)。而原阳地区明显低于中牟(χ2=14.507，P<0.001)、荥阳 (χ2=81.497，P<0.001)、许昌(χ2=29.354，P<0.001)、新郑(χ2=17.790，P<0.001)4个地区。河南省这 5个地区奶牛场毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫检出率及基因型分布详见表2。

表2 各养殖场毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫感染率和基因型Tab.2 Prevalence and genotypes of E. bieneusi and Blastocystis sp. in different farms

2.2 各年龄段奶牛毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫感染率 分析不同年龄段奶牛毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫感染率发现，6月龄以上的毕氏微孢子虫感染率13.0%(71/548)，明显低于6月龄以下奶牛的感染率31.8%(150/472)(χ2=52.940,P<0.001)，6月龄以内奶牛毕氏肠微孢子虫感染率较高；芽囊原虫在4个年龄段感染率差异有统计学意义(χ2=45.013,P<0.01)，其中1～6月龄和12月龄以上的奶牛芽囊原虫感染率较高(图1、图2)。

注：柱状图表示不同基因型毕氏肠微孢子虫阳性数量，折线图反映各年龄段感染率变化。图1 各年龄段奶牛毕氏肠微孢子虫感染率及基因型Fig.1 Infection and genotype distribution of E. bieneusi in different age groups

注：柱状图表示不同基因型芽囊原虫阳性数量，折线图反映各年龄段感染率变化。图2 各年龄段奶牛芽囊原虫感染率及基因型Fig.2 Infection and genotype distribution of Blastocystis sp. in different age groups

2.3 毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫序列分析及基因型鉴定 毕氏肠微孢子虫共检测到9种基因型，分别为J(126)、BEB4(25)、BEB6(22)、HNWW2(21)、I(16)、D(6)、CHG2(4)、NHD1(2)、EbpA(2)。其中基因型J为优势基因型，占比57.0%，其次为基因型BEB4(11.3%)、BEB6(10.0%)、HNWW2(9.5%)和I(7.2%)。

芽囊原虫共检测出6种基因型，分别为ST10(111)、ST5(39)、ST14(37)、ST4(6)、ST2(2)、ST1(1)。其中ST10占比56.6%，为此次调查研究的芽囊原虫优势基因型，随后为ST5(19.9%)和ST14(18.9%)。

3 讨 论

毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫在世界范围内感染人类和多种哺乳动物，本次调查显示河南地区奶牛毕氏肠微孢子虫总体感染率为21.7%(221/1 020)，Zhang等[11]报道显示全世界牛科动物毕氏肠微孢子虫的感染率为3.1%～37.6%，此次调查结果也在此范围内。本研究显示奶牛微孢子虫感染率与年龄相关，成年牛和育成牛感染率大于犊牛，这与从前的报道相符合[13-16]。报道显示毕氏肠微孢子虫感染率还与粪便状态、养殖模式、季节等因素有关，腹泻样品相对于正常粪便样品更易检出，圈养奶牛感染微孢子虫的风险显著低于放养奶牛[12]，微孢子虫在秋季的检出率显著低于春季[11]。样品采集的季节以及样品中来源于放养奶牛的比例、各年龄段奶牛所占比例是造成感染率差异的部分影响因素。

本研究调查河南地区奶牛芽囊原虫感染率为19.2%(196/1 020)，显著高于东北地区奶牛的感染率10.3%(54/526)[17]和黑龙江地区感染率9.5%(14/147)[18]，以及广东地区的感染率1.88%(9/479)[19]。世界各国奶牛芽囊原虫感染率为2.9%～54.1%[20-23]。报道显示3—12月龄牛感染率较高[21]，6月龄以上的牦牛感染率较高[24]，此次研究显示1—6月龄及12月龄以上奶牛感染率较高，不同年龄段奶牛芽囊原虫感染率没有明显的线性关系，该结论与两者研究结论不尽相同，但部分重叠；夏季的牛芽囊原虫检出率显著高于其他季节[21-24]，正常粪便芽囊原虫检出率显著高于水样粪便和血样粪便等其他粪便类型[21]。奶牛芽囊原虫感染率可能受年龄、季节以及粪便状态影响，但具体的规律仍需要更多的研究进一步证明。

本次调查研究共检测出9种毕氏肠微孢子虫ITS基因型(D、J、I、BEB4、BEB6、NHD1、HNWW2、CHG2、EbpA)，其中5种为潜在的人兽共患基因型，分别为属于group1的基因型D(6例)和group2的基因型J(126例)、I(16例)、BEB4(25例)、BEB6(22例)。毕氏肠微孢子虫亚型J分布范围最广，检出率占比最高(57.0%)，为此次研究中毕氏肠微孢子虫的优势基因型。与之前的报道一致[11]。本次调查共检测出6种芽囊原虫基因型(ST1、ST2、ST4、ST5、ST10、ST14)，其中ST1、ST2、ST4、ST5为人兽共患基因型，ST1和ST2仅检测到1例，ST4检测到5例，ST5检测到35例。芽囊原虫ST10检出率占比最高(56.6%)为此次研究中的优势基因型；而人兽共患基因型ST5在5个地区奶牛场中均有检出。

不同年龄段奶牛的毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫感染情况有所差异，并且6月龄以内的奶牛毕氏肠微孢子虫感染率较高；而芽囊原虫感染率在各个年龄段差异显著，但是没有观察到明显的分布规律，毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫均主要通过粪口传播，并且作为机会致病性病原，对免疫系统尚未发育成熟的犊牛危害较大，因此应该加强对犊牛的管理，及时清理粪便，勤换垫料。

本研究对河南省奶牛毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫流行情况进行了分子流行病学调查研究，首次报道了河南省奶牛芽囊原虫的流行及基因分布情况。毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫在各个年龄段奶牛中均有检出，且有人兽共患基因型检出，表示河南地区奶牛微孢子虫和芽囊原虫有人兽共患风险，需做好防控措施。