嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌德氏亚种计数方法的比对研究

凌莉 许秋贝 陈碧玲 安虹 彭小莉 吕敬章

(1.广州海关技术中心 广东广州 510623；2.厦门海关技术中心；3.安徽省食品药品检验研究院；4.深圳市检验检疫科学研究院)

1 前言

嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌德氏亚种是传统发酵乳的主要发酵剂[1]，嗜热链球菌在发酵过程中产生大量的风味物质，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌德氏亚种的不同添加比例造就了发酵乳的不同口味[2]。研究表明，口感较丰富的发酵乳中球菌与杆菌的比例一般大于1[3-5]。嗜热链球菌为兼性厌氧菌，对营养要求较高，对酸性环境的耐受性较差[6]。而保加利亚乳杆菌德氏亚种为微需氧菌，有氧环境下生长不良，但在酸性环境下生长良好[1，7]。

对包括嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌德氏亚种在内的乳酸菌总数的计数，一般采用MRS琼脂进行厌氧培养[8]，该计数方法得到了广泛运用[9]。对嗜热链球菌的计数，大多采用M17琼脂进行有氧培养[10-11]，我国的现行标准采用的是MC琼脂进行有氧培养[12]。对保加利亚乳杆菌德氏亚种的计数，大多采用酸化MRS琼脂进行厌氧培养[6，11]。在我国的乳酸菌检验标准中，对包括保加利亚乳杆菌德氏亚种在内的乳杆菌，采用的是MRS琼脂厌氧培养法[12]。为比较不同计数培养基和培养方法对嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌德氏亚种计数结果的影响，本文采用MRS琼脂和酸化MRS琼脂厌氧培养，MC琼脂有氧培养的方法，分别对含嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌德氏亚种的菌粉以及市售发酵乳中的乳酸菌计数，进行了比对研究。

2 材料与方法

2.1 试剂与仪器

2.1.1 主要试剂

MC琼脂、MRS琼脂均(北京陆桥技术股份有限公司)；在MRS琼脂中添加醋酸至pH 5.4，成为酸化MRS。

2.1.2 主要仪器

拍打器：Interscience Bag Mixer 400VW拍击式均质器(法国)；恒温培养箱：MEMMERT ICP600(德国)；厌氧培养系统：MARKⅡ(荷兰)。

2.1.3 实验样品

S菌粉(奶粉基质、嗜热链球菌添加量约为107CFU/g)；SL菌粉(奶粉基质、嗜热链球菌添加量约为107CFU/g、保加利亚乳杆菌德氏亚种添加量约为106CFU/g)，由江苏省微康生物科技有限公司提供。不同品牌的市售发酵乳6份(配料表中只添加嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌德氏亚种2种菌株)。

2.2 实验方法

无菌取样25 g样品置于装有225 mL无菌生理盐水的均质袋中，均质2 min，选取2～3个合适的稀释度，吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿，然后分别倾注冷却至48℃的MRS琼脂、酸化MRS琼脂，36℃厌氧培养72 h；同时倾注MC琼脂，36℃需氧培养72 h。15 min内完成从样品稀释到平皿倾注。每个菌粉样品重复6次实验。

3 结果与分析

3.1 S菌粉的计数结果及分析

S菌粉的MRS琼脂厌氧培养以及MC琼脂有氧培养的计数结果，均在嗜热链球菌添加量的范围内，但MRS琼脂厌氧培养结果高于MC琼脂有氧培养的结果，且二者之间有极显著性差异(P<0.01)。S菌粉中添加的是嗜热链球菌，该菌为兼性厌氧菌，在有氧及厌氧条件下均可生长。用MRS琼脂进行厌氧培养的方法，适用于包括嗜热链球菌在内的乳酸菌总数的计数。但是MC琼脂由于营养不足和缓冲能力差，对嗜热链球菌的计数结果偏低[13]，详见表1。

表1 S菌粉的计数结果

酸化MRS琼脂厌氧培养计数结果低于MRS琼脂厌氧培养结果，且具有极显著性差异(P<0.01)，这是由于嗜热链球菌不耐酸的原因[6]。

3.2 SL菌粉的计数结果及分析

SL菌粉中嗜热链球菌添加量约为107CFU/g、保加利亚乳杆菌德氏亚种的添加量约为嗜热链球菌的1/10。由表2可见，SL菌粉的MRS琼脂厌氧培养的计数结果，在添加的菌量范围内。MRS琼脂厌氧培养结果高于MC琼脂有氧培养的结果，且二者之间有显著性差异(P<0.05)，这也是由于MC琼脂有氧培养，对嗜热链球菌的计数结果偏低的原因。

酸化MRS琼脂厌氧培养计数结果低于MRS琼脂厌氧培养结果，且具有极显著性差异(P<0.01)，由于嗜热链球菌不耐酸，酸化MRS琼脂上生长的是保加利亚乳杆菌德氏亚种，而且其计数结果约为MRS琼脂厌氧培养结果的1/10，这与SL菌粉中乳酸菌的添加量一致。

由于MC琼脂有氧培养，对嗜热链球菌的计数结果偏低，MC琼脂计数的嗜热链球菌数与酸化MRS琼脂计数的是保加利亚乳杆菌德氏亚种数量之和，也小于MRS琼脂厌氧培养的计数的乳酸菌总数，且二者之间有显著性差异(P<0.05)，详见表2。

表2 SL菌粉的计数结果

SL菌粉的MRS琼脂平板，有大小2种菌落(图1)：大菌落为圆形、湿润、灰白色菌落；小菌落中等偏小，边缘整齐光滑。随机挑取大小菌落各10个进行革兰氏染色镜检，结果显示：大菌落均为革兰氏阳性杆菌(图3)；小菌落均为革兰氏阳性球菌，呈短链状(图4)。酸化MRS琼脂上只有一种圆形大菌落，边缘粗糙(图2)，镜检结果为革兰氏阳性杆菌。

3.3 市售发酵乳品的计数结果及分析

从表3数据可知，对于6份不同品牌的市售发酵乳产品，酸化MRS琼脂厌氧培养计数结果低于MRS琼脂厌氧培养结果，且具有极显著性差异(P<0.01)。同时，MRS琼脂厌氧培养结果高于MC琼脂有氧培养的结果，且二者之间有显著性差异(P<0.05)。另外，MC琼脂计数的嗜热链球菌数与酸化MRS琼脂计数的是保加利亚乳杆菌德氏亚种数量之和，也小于MRS琼脂厌氧培养的计数的乳酸菌总数，且二者之间有显著性差异(P<0.05)。

表3 发酵乳计数结果

4 结论

嗜热链球菌为兼性厌氧菌，在有氧及厌氧条件下均可生长，但是不耐酸且对营养要求高，对嗜热链球菌的计数一般采用缓冲能力强且营养丰富的M17琼脂[10-11]。虽然MC琼脂在有氧培养条件下，可抑制常与嗜热链球菌共同作为发酵剂的保加利亚乳杆菌德氏亚种的生长，但大量文献报道及比对研究表明[13]，MC琼脂对嗜热链球菌的计数结果显著低于M17琼脂。本研究进一步发现，MC琼脂有氧培养的方法对嗜热链球菌的计数结果，也显著低于MRS琼脂厌氧培养的方法。因此，MC琼脂并不适用于嗜热链球菌的计数。

因为乳杆菌能耐受酸性环境，所以对乳杆菌的计数大多采用酸化MRS琼脂进行厌氧培养[6，11]。同时pH 5.4的酸性环境不利于常和保加利亚乳杆菌德氏亚种共同作为发酵剂的嗜热链球菌的复苏，对于嗜热链球菌的添加量远大于保加利亚乳杆菌德氏亚种的SL菌粉，酸化的MRS琼脂上生长的菌落仍以保加利亚乳杆菌德氏亚种为主，这与文献报道一致[14]。

MRS厌氧培养的方法常用于乳酸菌总数的计数[8]，采用该方法对SL菌粉计数时，MRS琼脂上同时嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌德氏亚种，与文献报道一致[15]。对于含有嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌德氏亚种的产品，可采用酸化MRS琼脂计数保加利亚乳杆菌德氏亚种，采用M17琼脂计数嗜热链球菌，其乳酸菌总数则为酸化MRS计数结果与M17琼脂计数结果之和。由于厌氧培养MRS琼脂上可同时生长嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌德氏亚种，对于含有嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌德氏亚种的产品，如果采用MRS琼脂计数结果与嗜热链球菌计数结果之和，作为乳酸菌总数的计数结果，则会造成嗜热链球菌的重复计数。