不同加工方法对猪源性肉类基因组DNA提取效果影响的比较研究

魏晓雅 陈健 李婷婷 刘德星 岳巧云

(中山海关技术中心 广东中山 528403)

1 前言

动物源性食品与人类生产生活息息相关，是民生的重要消费品。各国政府都针对动物源性食品安全监管制定了严厉的政策法规，但仍有少数不法分子在利益驱动下，通过各种手段进行掺杂造假，如2013年席卷欧洲的“马肉事件”、明星火锅店“牛血冒充鸭血”事件、“淡水虹鳟鱼冒充三文鱼”事件等，给食品安全的监管工作带来巨大挑战，也对动物源性食品的种类鉴别工作提出更高的要求，尤其是对深加工食品的成分准确和快速鉴定方法提出了迫切需求。

在深加工食品的加工过程中，切割、搅拌，食品添加剂、防腐剂，高温高压等处理都会改变原材料的形态、味道和口感，这导致深加工食品原材料的物种鉴别变得非常困难。目前国内外对深加工食品物种鉴别的常见方法有：显微观察法、光谱分析法、质谱分析法、免疫分析法、电泳分析法等，这些方法因假阳性率高、性价比低、特异性差、灵敏度低等不能广泛应用，随着现代分子生物学检测技术的发展，DNA条形码技术在深加工食品的物种鉴定工作中具有更广阔的的前景[1]。

DNA条形码(DNA barcoding)是利用生物本身所具有的一段或几段易扩增的、标准的、有足够变异的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的技术[2]，DNA条形码技术不受动物源性加工食品原始可识别形态特征的限制，技术标准化，目前已广泛应用于动物源性加工食品类物种鉴定，如陈健[3]利用DNA条形码技术检测36份调理肉制品的成分，发现其中29份样品成分与标识成分不符；Quinto[4]利用DNA条形码技术测定54份美国境内零售商出售的野生动物肉制品成分，发现18.5%的野生动物肉制品存在虚假标签的问题；石盼盼[5]利用DNA条形码技术发现河南省范围内大型超市牛肉产品掺杂猪肉和鸡肉的情况比较严重。

在动物源性加工食品的加工过程中，不仅改变了原材料的外观，导致检测人员无法利用形态、味道和色泽等外观特征进行种类判断，还有可能造成原材料核酸成分的降解，从而导致分子检测结果的不理想。因此，本文探索不同加工方式(腌制、高压、炸、烧、炒、蒸、炖煮)处理的猪肉样品对基因组DNA提取效果的影响，通过对比分析进行确认，并在此基础上优化PCR反应体系，实现加工食品中动物源性成分的鉴定，以期为食品安全监管提供技术支持，保证广大消费者的利益。

2 材料与制备

2.1 实验材料

新鲜猪肉样品、调味料均购自本地超市。

2.2 加工方法

2.2.1 不同腌制方式

对新鲜猪肉样品切薄片后均匀分成9份，1份为对照，不添加任何调味料腌制，在4℃条件下放置24 h；8份为实验组，其中4份用调味料(食盐、酱油、食盐加酱油、混合调料)在4℃条件下腌制24 h[6]，调味料的用量为样品重量的1%[7]；另外4份用对应的调味料(食盐、酱油、食盐加酱油、混合调料)在4℃腌制24 h，调味料的用量为样品重量的10%。

2.2.2 高压

将不同调味料腌制的样品和对照样品分别置于干净的容器中，在高压灭菌锅中，121℃处理20 min，取出晾凉备用。

2.2.3 不同烹饪方式

不同调味料腌制的样品和对照样品分别进行以下处理：经炸、炖、炒、蒸、炖煮烹饪至熟透(按照家庭常用烹饪方法操作)，具体方法如下：

(1)炸：在锅中加入适量且等量的油，油烧热后，将样品分别放入锅中炸熟，待样品在油锅中浮起后取出晾凉备用。

(2)烧：热锅中放入适量且等量的油，样品分别放入炒制变色后，加入适量且等量的水，大火煮沸，小火至汤汁收干，取出晾凉备用。

(3)炒：在锅中加入适量且等量的油，样品分别放入锅中炒熟，取出晾凉备用。

(4)蒸：蒸锅中倒入开水，样品分别放入蒸锅中，蒸熟，取出晾凉备用。

(5)炖煮：在锅中加入适量且等量的水烧开后，将样品分别放入锅中，充分炖熟，取出晾凉备用。

2.2.4 不同炖煮时间

在锅中加入适量且等量的水烧开后，将不同调味料腌制的样品和对照样品，分别放入锅中，分别炖煮0.5 h、1 h、1.5 h、2 h后依次捞出，晾凉备用。

3 试剂与仪器

Ex Taq酶、dNTP、10×buffer、琼脂糖、6×Loading buffer及引物(宝生物工程(大连)有限公司)；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(目录号DP304-03)及DNA markerII(天根生物科技有限公司)；SYBR Green I(广州普博欣科技有限公司)；50×TAE(索莱宝生物科技有限公司)。

GR60DR高压灭菌锅(美国ZEALWAY公司)；PIC017微量台式离心机(美国HERAEUS公司)；PCMT恒温金属浴(英国Grant公司)；ABI Proflex三槽PCR仪(美国ABI公司)；DYY-6C电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；D-55-26M-AUTO凝胶成像仪(美国UVP公司)。

4 试验方法

4.1 DNA提取

处理完毕的样品及对照样品，每份各取30 mg放入1个1.5 ml离心管中备用，不对样品进行任何脱油脱盐的处理，直接按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书指导提取基因组DNA。

4.2 PCR反应体系的优化

4.2.1 引物对PCR反应结果的影响

本研究共选用5对多细胞脊椎动物DNA条形码的通用引物，先使用不同烹饪方式处理过的样品，探索出适用性较佳的引物，优先使用扩增长度为658 bp/702 bp的引物对样品DNA进行扩增，扩增不出后再选用扩增长度为244 bp/376 bp/472 bp的引物对样品DNA进行扩增。引物信息详见表1[8-10]。

表1 引物信息表

4.2.2 退火温度对PCR反应结果的影响

使用未经任何方式处理过的样品，采用温度梯度PCR反应，每隔2°设置温度梯度。温度范围设定为：42～68℃。

PCR反应体系(50μl)：10×buffer 5μl；正向引物(20 nmol/μl)1μl；反向引物(20 nmol/μl)1μl；dNTP(10 nmol/μl)2μl；EX-Taq(5 U/μl)0.5μl；模板DNA(60 ng/μl)1μl；无菌水定容至50μl[11]。

Ex-Taq DNA聚合酶扩增条件：94℃变性5min；94℃、30s；42-68℃、30s；72℃、10min；30个 循 环；72℃延伸10min。

PCR扩增完成后，经1%琼脂糖进行电泳分离后，使用凝胶成像系统分析扩增产物。

4.3 测序

成功扩增的PCR产物送至广州天一辉远科技有限公司进行测序。测序引物同扩增引物。

5 结果与分析

5.1 引物适用性

先使用不同加工方式(腌制、炸、烧、炒、蒸、炖煮)处理过的样品，用引物LCO1490/HCO2198以及BatL5310/R6036R，退火温度参照参考文献[11]使用50℃，对所有样品进行扩增，扩增结果(图1)表明，对不同加工方式处理过的样品，引物BatL5310/R6036R的适用性明显优于LCO1490/HCO2198。

5.2 退火温度

使用未经任何方式处理过的样品，探索PCR的最适退火温度，每隔2°设置温度梯度，温度范围设定为：42～68℃。PCR扩增结果(图2)显示退火温度的上限在68℃左右后，从62℃(11泳道)起，未出现杂带，将在不同退火温度梯度下扩增的PCR产物全部送测序，获得的序列完全一致。综合考虑扩增引物的适用性和扩增效率使用62℃退火温度对不同加工方式处理的样品的DNA进行扩增，PCR扩增结果见图3。

5.3 加工方式

由图3和4可知，不同浓度的调味料腌制的样品对扩增效果并无影响，不同烹饪方式(炸、烧、炒、蒸)处理过的样品对扩增效果也无影响，但随着炖煮时间的增长，对扩增效果会有影响，当炖煮时间达到1.5 h时，条带亮度明显减弱；当炖煮时间达到2 h时，当使用引物BatL5310/R6036R只有部分样品有扩增条带，但全部样品均可用短片段引物(244 bp/376 bp/472 bp的片段)扩增出(图5)。

经高压处理过的样品都不能扩增出658 bp/702 bp大小的片段，但能全部扩增出244 bp大小的片段，部分样品能扩增出376/472 bp的片段(图6)，说明经高压处理的样品，DNA受到了一定程度的破坏，不易扩增出大片段的基因。

5.4 应用

随机购买8种加工动物源性食品，应用上述方法对购买的样品进行物种鉴定，将PCR检测结果为阳性的样品送至广州天一辉远科技有限公司进行测序，测序结果与GenBank中的序列进行比对，PCR检测及DNA条形码鉴定结果见表2，说明该方法不仅适用于市售加工猪肉类食品的物种鉴定，也可以应用于其他种类动物源性加工食品成分份的检测。

表2 加工动物源性食品的PCR检测及DNA条形码鉴定结果

6 讨论

本文探索了不同加工方式对猪肉基因组DNA提取的影响，并对PCR反应体系进行优化，通过对样品DNA的PCR扩增产物进行测序即可鉴别物种来源。结果表明，一般的常见加工方式(腌制、炸、烧、炒、蒸、炖煮)对扩增效果并无影响，而随着烹饪时间或者温度压强的增加，DNA受到了一定程度的破坏，对扩增效果则有影响。试验结果与黄娅琳[12]、Arslan[13]等研究结果一致，可用扩增短片段的引物进行扩增。猪肉样品的检测，引物用BatL5310/R6036R，退火温度选择62℃，扩增效果良好。相比现有相同技术的物种鉴定方法，本方法操作便捷、所需仪器设备简单、检测成本低，适用于对市售常见加工猪肉类样品物种鉴定，亦可推广应用于其他肉类样品的检测，在应用此方法对其他肉类样品进行物种鉴定过程中发现，烟熏的加工方式对长片段的扩增可能会有影响，将在后续的研究中进一步探讨。