菲对融合菌株F14胞外聚合物特征的影响

刘怡暄，高 乔，王舒淇，吕岳骏，高于涵，汪 杰，侯 彬，卢 静

（中北大学环境与安全工程学院，山西 太原 030051）

0 引言

多环芳烃 （Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs）是指2 个以上苯环以稠环形式相连的有机化合物，它普遍存在于环境中，性质稳定，难于降解，且具有潜在的致畸性、致癌性和致突变性[1]。环境中PAHs 的主要来源于人类活动，如废物、化石燃料和其他碳氢化合物的不完全燃烧、工业生产、食品加工过程以及原油的泄漏等[2]。菲作为PAHs 中的一种重要污染物，常被用于对PAHs 的实验研究。微生物修复技术因其操作较为简单，修复效果好，对环境影响微弱，几乎无二次污染等优点，越来越受到专家学者的关注，成为去除PAHs 的主要途径。

微生物在新陈代谢过程中，分泌出一种附着于微生物表面及周围环境的高分子聚合物质，称为胞外聚合物（Extracellular Polymertic Substances，EPS）。它主要由多糖和蛋白质构成（两者在EPS 成分中占比为70% ～ 80%），除此之外还包含少量的核酸、腐殖酸等[3-4]。张颖等[5]在研究Arthrobacter sp.JQ-1 菌株胞外聚合物对不同浓度酞酸酯类化合物的吸附规律时，发现微生物的EPS 表面有非极性官能团，其中包括蛋白质中的脂肪族化合物、芳香族化合物及多糖中的疏水区域，这些组分参与了微生物对酞酸酯类化合物的降解过程。PAN Xiang-liang 等[6]研究表明，好氧活性污泥产生的EPS 和菲之间的作用是自发进行的，它们之间的结合主要依靠于疏水作用。LIU An-bo 等[7]研究表明，细菌产生的EPS 可促进土壤中菲进行解吸过程。甄凯等[8]研究表明，Seudomonas sp.DNBe-S1 产生的EPS 可促进土壤中苯并芘的降解。

融合菌株F14 是以菲降解菌Sphingomonas sp.GY2B 和芘降解菌Pseudomomas sp.GP3A 为亲本，通过原生质体融合技术构建的一株高效降解多环芳烃的降解菌[9]。与亲本相比，该菌株具有更广的温度（20 ～40 ℃）和pH 值适应范围（6.5 ～9），对菲的降解效率更高，而且具有和亲本GY2B 不同的菲降解途径，融合菌株F14 具有2 条菲代谢途径并且在降解过程中较少积累有毒中间代谢产物。

基于此，通过系统研究不同浓度菲诱导下对融合菌株F14 胞外聚合物 （Extracellular Polymertic Substances，EPS）的影响，包括EPS 中蛋白质和多糖含量的变化、对降解效率与荧光性能的影响，并通过FTIR 和SEM 进一步分析了EPS 表面官能团的变化和微观形貌的变化，阐示融合菌株F14 降解菲的作用机理，为融合菌株F14 实地修复菲污染提供科学依据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料及样品

研究使用的菲（浓度为98%）、甲醇（色谱纯）、正己烷（分析纯）、二氯甲烷（色谱纯）等试剂，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其余试剂无特殊说明均为分析纯。

无机盐基础培养液（MSM）：分别取5 mL 磷酸盐缓冲液 （KH2PO4，8.5 g/L；K2HPO4·H2O，21.75 g/L；Na2HPO4·12H2O，33.4 g/L；（NH4）Cl，5.0 g/L）、3 mL MgSO4溶液（22.5 g/L），1 mL CaCl2溶液（36.4 g/L），1 mL FeCl3溶液 （0.25 g/L），1 mL 微量元素（MnSO4·H2O，39.9 mg/L；ZnSO4·H2O，42.8 mg/L；（NH4）6Mo7O24·4H2O，34.7 mg/L），然后加入超纯水定容至1 L，调节培养基pH 值为6.8，在121 ℃高压灭菌锅中灭菌20 min 后备用。

含有菲的无机盐培养液（质量浓度分别为0，60，100，230 mg/L）：在灭菌的三角瓶中加入不同量的菲标准储备液（5 g/L，正己烷为溶剂配制），待正己烷挥发完毕，加入灭菌后的MSM。

实验菌种：融合菌株F14 利用原生质体融合技术融合而成[9]。

1.2 菲对融合菌株F14 的驯化

按照10% 的接种量，将融合菌株F14 菌液接种到含有不同质量浓度（0，60，100，230 mg/L）菲的无机盐培养液（总体积为30 mL）中，将其置于30 ℃、转速为120 r/min 的摇床培养箱中，培养24 h 后，提取EPS。

1.3 融合菌株F14 的EPS 的提取

采用加热法提取EPS。首先，取30 mL 融合菌株F14 菌液，于转速为2 000 r/min 低温冷冻离心机中离心10 min，丢弃上清液，补充无菌水至原体积，再于转速为2 000 r/min 离心3 min，丢弃上清液，补充无菌水至原体积，将上述步骤重复2 次。然后，将获得的溶液放入水浴锅（60 ℃）加热30 min，再次放入离心机中，于8 000 r/min 转速下离心15 min，最后将收集的上清液经0.22 μm 滤膜过滤，即为EPS 溶液。同时将部分溶液在低温冷冻干燥机中干燥24 h，所得粉末用于后续检测[10]。

1.4 驯化后的EPS 降解菲

取0.2 mL 质量浓度为5 g/L 菲的储备液于三角瓶中，待正己烷挥发后，分别加入10 mL 上述提取的EPS 溶液，对照组为10 mL 水，用保鲜膜密封，置于30 ℃、转速为120 r/min 摇床中震荡24 h 后取样。每组试验设3 组平行，并将其进行编号，菲质量浓度分别为0，60，100，230 mg/L，对应编号为a,b,c,d，对照组编号为0。

1.5 分析方法

1.5.1 EPS 主要成分分析

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质；采用蒽酮-硫酸分光光度计法测定多糖[11]。

1.5.2 菲的提取及含量测定

采用液相萃取法提取菲，首先向样品中加入等体积的二氯甲烷，振荡5 min（30 ℃，转速为180 r/min），随后全部转移至分液漏斗，待静置分层后，将下层有机相放入烧杯，上述步骤重复3 次。再使用氮气吹脱仪将溶液吹至近干，最后过0.22 μm 有机滤膜后全部移入进样瓶中，并用甲醇定容。

使用岛津高效液相色谱（HPLC（20A））测定菲的剩余量，并计算菲的降解率。

1.5.3 EPS 三维荧光光谱分析

将提取出来的EPS 溶液进行三维荧光测定，分析不同浓度菲诱导后产生的EPS 蛋白峰的变化情况。

1.5.4 EPS 傅里叶红外光谱分析

取冻干后的EPS 粉末，使用红外光谱仪（Thermo Scientific Nicolet iS5）采用KBr 压片法进行测试，分析不同浓度菲诱导后产生的EPS 主要成分及官能团变化。

1.5.5 EPS 形貌特征分析

利用扫描电镜（ZEISS MERLIN Compact）观察不同浓度菲诱导后产生的EPS 表面形貌变化。

2 结果与分析

2.1 不同浓度菲诱导EPS 成分的变化

不同浓度菲诱导产生EPS 成分的变化见图1。菲对融合菌株F14 的EPS 的产生及成分变化有一定影响。当菲质量浓度由0 mg/L 增至230 mg/L 时，EPS 中的蛋白质和多糖呈先增后减的变化规律。当菲质量浓度为0 mg/L 时，EPS 中多糖含量大于蛋白质含量，当菲质量浓度由0 mg/L 增至100 mg/L 时，蛋白质和多糖均有不同程度的增加，推断原因可能是融合菌株F14 为抵御外界不利因素的影响，提高其耐受性，分泌了大量的EPS。当菲质量浓度为100 mg/L 时，蛋白质和多糖的浓度分别达到最大值。而当菲质量浓度达到230 mg/L 时，蛋白质和多糖的含量均降低，这说明过高浓度的菲会对微生物产生毒性，从而抑制其生长，进而影响EPS 的分泌。简静仪等[12]研究发现，随着加入Zn2+和Cu2+浓度的增加，死谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）产生的EPS 呈增加趋势，且不同种类的重金属，胁迫后产生的EPS 成分变化也存在明显差异。唐蕊等[13]也在不同浓度的苯并[a]芘驯化毛霉的实验中，发现随着污染物浓度的增加，EPS 中的多糖和蛋白质含量呈先增后减的趋势。

2.2 不同浓度菲诱导对EPS 降解能力的影响

融合菌株F14 产生的EPS 对菲也有一定的降解作用，降解效果见图2。由图2 可以看出，随着时间的变化，不同浓度菲诱导后EPS 对菲的降解率均呈先高后低的趋势，12 h 时降解率达到最大值，且菲的诱导质量浓度为100 mg/L 时，EPS 的降解效果最好。林治岐等[14]提出EPS 对菲有吸附，主要是通过EPS 中的疏水区与菲发生疏水作用。JIA Chan-yan等[15]通过对Zoogloea sp.和Aspergillus niger 产生的EPS 对土壤中芘降解效果的研究发现，EPS 对芘的降解，前期是在EPS 与芘之间的相互疏水作用下，两者结合在一起，随后EPS 中的酶参与了芘的降解过程。在12 h 内，不同浓度菲诱导后的EPS 降解率均有升高，但是随着时间的变化，降解率逐渐降低，推断原因可能是EPS 降解菲的过程中，先将菲吸附在EPS 表面的吸附位点上，后再由EPS 中的酶进行降解，但是酶的产量不足以将吸附位点上的菲完全降解，随着时间的变化，未降解的菲又逐渐回到溶液中，从而导致EPS 降解率降低。在24 h 时，质量浓度为0 mg/L 的菲诱导后的EPS 降解效率明显高于菲的质量浓度分别为60 和230 mg/L 的菲，推断原因可能是EPS 在前期诱导过程中已与菲结合，使得EPS 表面吸附位点减少，且消耗了部分蛋白酶，从而导致生物吸附能力降低。而当菲的诱导质量浓度为230 mg/L 时，降解效果减弱，推断原因可能是过高浓度的菲会抑制微生物的生长，影响EPS 的产生。综上所述，经过菲诱导后的EPS 降解效果会提高，且菲的质量浓度为100 mg/L 时降解效果最佳。

2.3 不同浓度菲诱导下对EPS 三维荧光光谱的影响

不同浓度菲诱导产生的EPS 三维荧光的图像见图1。

不同浓度菲诱导产生的EPS 三维荧光的分析结果见表1。

表1 不同浓度菲诱导下EPS 三维荧光光谱分析结果

由表1 可以看出，峰A 为酪氨酸蛋白峰：Ex，Em=280，335 nm；峰B 为色氨酸蛋白峰：Ex，Em=230，（330～335）nm。这2 个峰在菌体形成聚集体和稳定结构的过程中发挥了重要作用[16]，且与EPS 中的芳香环氨基酸结构有关[17]。

由图3 和表1 可以看出，当菲质量浓度由0 mg/L增至100 mg/L，蛋白峰强度逐渐增强，色氨酸和酪氨酸的含量也逐渐增加，这说明菲对融合菌株F14 产生胞外蛋白起到了显著的促进作用。当菲质量浓度为100 mg/L 时，峰A 和峰B 强度达到最大，分别为446.0 和573.9；当菲质量浓度由100 mg/L 增至230 mg/L 时，蛋白峰强度明显减弱。分析原因可能是菲处于低浓度时，不易与菌体充分接触，菌体可利用的能源物质较少，影响菌体的生长代谢。随着菲浓度的增加，菌体的代谢增强，分泌出胞外蛋白增多，所以蛋白峰明显增强，但是菲浓度过高则会影响菌体正常分泌胞外蛋白，从而导致蛋白峰减弱。随着菲的加入，EPS 的蛋白峰强度发生了变化，直接影响了EPS对菲的降解作用。ZHU Liang 等[18]在对不同种类污泥的EPS 提取过程中发现，酪氨酸和色氨酸蛋白峰强度发生了改变，这表明蛋白质在生物代谢降解过程中起到了主要作用。ZHANG Jing 等[19]得出结论，1-羟基芘能与牛血清蛋白中的色氨酸残基发生键合作用。

2.4 不同浓度菲诱导下对EPS 红外光谱的影响

为确定不同浓度菲诱导产生EPS 官能团的差异，对EPS 进行了FTIR 光谱分析，结果见表2 和图4。由表2 和图4 可以看出，4 000 到1 000 cm-1之间的吸收峰能够反映出EPS 的基本组成部分，主要是蛋白质和多糖[20]。3 400 ～ 3 200 cm-1区间的吸收峰强而宽，可归属为O-H 拉伸振动和蛋白质的N-H键伸缩振动吸收峰；位于1656.51 cm-1处的酰胺（O=CN-H）Ⅰ带（1 700～1 600 cm-1），是蛋白质功能组中具有代表性的重要部分，属于C=O 伸缩振动；位于1 550.97 cm-1处的酰胺Ⅱ带（1 600～1 500 cm-1），是N-H 弯曲振动和C-N 拉伸振动的耦合产生；羧基的C=O 和C-O 伸缩振动峰分别出现在1 403.28 和1 243.65 cm-1；位于1 104.53 cm-1处的是多糖（1 200～1 000 cm-1）的O-H 和C-O-C 的伸缩振动。

表2 FTIR 观察到的不同浓度菲诱导下EPS 主要基团

图4 不同浓度菲诱导下EPS 红外光谱

对比可知，3 378.33 cm-1处的吸收峰发生了轻微移动且峰强度明显减弱，推断原因可能是N-H 键和O-H 键参与了对菲的降解过程。1 656.51 cm-1处的酰胺Ⅰ带诱导前是较为尖锐的吸收峰，诱导后，峰的强度先增强后减弱，推断原因可能是低浓度的菲刺激生成了蛋白质，而后随着菲浓度的增加，菲与EPS的接触更加紧密，蛋白质中的C=O 参与了降解过程。多糖区的吸收峰诱导后发生轻微移动，峰的强度也有所变化，说明在融合菌株F14 降解菲时，EPS 中多糖上的O-H 和C-O-C 键参与了反应。

很多资料表明，由于EPS 含有大量的负电荷官能团如羧基、羟基等，对有机污染物有很强的吸附能力[21]。通过对红外光谱图的分析可知：在融合菌株F14 降解菲的过程中，主要起作用的基团是羟基、氨基、酰胺基团和C-O-C 基团。

2.5 不同浓度菲诱导对EPS 形貌特征的影响

不同浓度菲诱导后EPS 的形貌变化情况见图5。由图5（a）可以看出，EPS 呈薄片状，且有明显的孔隙结构，随着菲浓度的增加，孔隙在逐渐变小，表面厚度增大，变得光滑圆润，结构密实，这说明为更好的保护菌体，避免菲的不利影响，促进了EPS 的大量产生。WIENS J R 等[22]研究表明：部分金属离子可以促进大肠杆菌、绿胳杆菌等微生物分泌大量的蛋白质与多糖。NIELSEN 等[23]认为微生物主要是利用松散结合型胞外聚合物（LB-EPS）和紧密结合型胞外聚合物（TB-EPS）来吸附有机物，与有机物结合后，EPS 会打破原有结构。由图5（d）可以看出,EPS表面的孔隙数明显减少，这不利于与菲的结合，降解效果会减弱。

图5 不同浓度菲诱导后EPS 扫描电镜

3 结论

（1）随着菲诱导浓度的增加，融合菌株F14 产生的EPS 中蛋白质和多糖均呈先大后减的变化趋势，且当菲诱导质量浓度为100 mg/L 时达到最大，推断原因可能是融合菌株F14 为抵御外界不利因素的影响，提高其耐受性，分泌了大量的EPS，但随着浓度的不断增加，毒性加大，抑制其生长。

（2）随着时间的变化，经不同浓度菲诱导的EPS降解率均呈先高后低的趋势，这说明在融合菌株F14 降解菲的过程中，EPS 先是通过疏水作用与菲结合，随后再利用产生的酶参与降解过程。菲的诱导有利于提高EPS 的降解效果，且质量浓度为100 mg/L 时降解效果最佳，在12 h 时，降解率达到最大值。

（3）在融合菌株F14 降解菲的过程中，EPS 中的蛋白质和多糖参与了反应，羟基、氨基、酰胺基团和C-O-C 基团也发挥了重要作用。

（4）随着菲诱导浓度的增加，EPS 的孔隙逐渐变小，表面也变得光滑密实，EPS 原有结构也发生变化，推断原因可能是为有效阻止菲的污染，分泌了大量物质，但浓度过高，孔隙会明显减少，不利于吸附降解，从而降解效果减弱。