Netrin1在颞叶癫痫大鼠再认记忆中的作用及机制

刘文萍，刘丽丹，徐佳骏，李达丽，彭颜晖

癫痫是大脑神经元反复、异常、同步放电所致的神经系统疾病[1]，其病程较长，部分患者会产生耐药而发展为难治性癫痫[2]。癫痫发生机制复杂，免疫异常、中枢神经系统感染、离子通道异常、遗传、颅脑损伤、先天及围产期异常、肿瘤、脑血管病、寄生虫病等都是可能致病因素[3,4]。颞叶癫痫是最常见的难治性癫痫，常伴发再认记忆障碍，以及焦虑、抑郁等精神症状[5]。再认记忆是指对既往发生过的人物、事件的再回想与记忆的认知过程。Netrin家族是最早发现的可溶性轴突导向分子，由一类结构上高度保守且与层粘连蛋白相关的可分泌蛋白组成[6]。以Netrin1为代表的Netrin家族通过DCC受体家族与UNC-5受体家族结合，具有传递化学吸引、排斥作用，在神经传导通路构建及神经细胞迁移过程中产生导向作用[7]。本研究探讨Netrin1在颞叶癫痫大鼠再认记忆中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，体质量180～200 g，由新疆医科大学实验动物中心提供；动物饲养于标准动物房，自由饮食水，规律光照。氯化锂购自成都曼思特科技有限公司；Netrin1单克隆抗体购于Abcam公司；qPCR试剂盒购于湖南诺科生物有限公司；Netrin1探针合成由大连TAKARA公司完成。实验步骤经新疆医科大学大学伦理委员会同意，且遵守动物实验的相关国际公约。

1.2 方法

1.2.1 造模 大鼠随机分为对照组与模型组，每组24只。模型组：腹腔注射氯化锂生理盐水（125 mg/kg），18 h后腹腔注射硫酸阿托品（1 mg/kg）降低毒副反应，再腹腔注射匹罗卡品（20 mg/kg）。将发作程度达Racine评分Ⅳ～Ⅴ级、癫痫状态持续＞30 min者纳入后续研究。经4～7 d静止期后出现自发性反复癫痫发作者判定为致痫成功。未成功致痫的大鼠剔除，补足入组大鼠至24只。对照组注射给予等剂量的生理盐水，余处理同模型组大鼠。癫痫分级标准（Racine评分）：无任何反应为0级；面部阵挛，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼等为Ⅰ级；Ⅰ级加节律性点头为Ⅱ级；Ⅱ级加前肢肌阵挛，但无后肢直立位为Ⅲ级；Ⅲ级加后肢直立位为Ⅳ级；全面性强直-阵挛发作，并失去体位控制为Ⅴ级。

1.2.2 观察指标 ①空间学习记忆功能评估：致痫成功后1、7、15 d，采用Morris水迷宫实验进行评估，记录每只大鼠的逃避潜伏期（大鼠自入水至找到水下救生平台所用的时间）；②致痫成功后1、7、15 d，取各组大鼠的海马组织，每个时间点取8只大鼠，荧光定量PCR检测Netrin1 mRNA转录水平，Western blot检测Netrin1蛋白表达水平（每种取4只大鼠）。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0软件处理数据。符合正态分布以及方差齐性的计量资料以（±s）表示，t检验或方差分析；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水迷宫逃避潜伏期比较

造模后1、7、15 d，模型组水迷宫逃避潜伏期均长于对照组（均P＜0.05），但组内差别无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 2组水迷宫逃避潜伏期比较（s,±s）

表1 2组水迷宫逃避潜伏期比较（s,±s）

注：与对照组比较，①P<0.05

组别对照组模型组只数4 4 1 d 17.2±4.8 55.3±4.8①7 d 16.8±3.8 54.0±8.3①15 d 17.1±4.1 53.9±4.6①

2.2 Netrin1 mRNA转录水平和蛋白表达水平比较

造模后1、7、15 d，模型组海马Netrin1 mRNA转录水平和蛋白表达水平均高于对照组（均P＜0.05），见表2。

表2 2组Netrin1 mRNA转录水平和蛋白表达水平比较（±s）

表2 2组Netrin1 mRNA转录水平和蛋白表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，①P<0.05

组别只数Netrin1 mRNA转录水平1 d 7 d 15 d对照组模型组4 4 0.67±0.13 2.31±0.05①0.56±0.05 2.09±0.10①0.62±0.11 2.23±0.21①组别对照组模型组Netrin1蛋白表达水平1 d 0.63±0.08 2.14±0.010①7 d 0.58±0.04 2.00±0.11①15 d 0.63±0.10 2.26±0.09①

3 讨论

再认记忆是记忆过程中的典型模式，再认记忆的形成结构基础包括视觉传导路、颞叶内侧结构、额叶和顶叶皮质。再认记忆的形成是脑网络不断激活的产物。Morris水迷宫是用来检测海马依赖的空间学习记忆能力的经典方法[8]。本研究显示模型组致痫后1、7、15 d的水迷宫实验逃避潜伏期都显著高于对照组，表明癫痫可伴随有再认记忆障碍。

血脑屏障的破坏可能是癫痫发生再认记忆障碍的机制之一。血脑屏障破坏后，大鼠癫痫发作阈降低；而血脑屏障内皮细胞中的Netrin1可能与血脑屏障的渗透性有关。Netrin1不仅是轴突导向分子，它还能调节细胞迁移，影响细胞与细胞之间，细胞与基质之间的粘附[9]。Netrin1也能够促进内皮细胞增殖，血管的分支过程和血管密度的增加，改善缺血状况的病理学症状[10]。在体外实验中，人脑源性的内皮细胞用Netrin1处理或与星形胶质细胞共培养，脂筏膜微区里的连接蛋白表达增加。连接蛋白相互作用，形成维持屏障完整性的功能簇。在体内，Netrin1基因敲除鼠也出现了紧密连接蛋白表达的紊乱和血脑屏障的破坏。因此，Netrin1是一个重要的血脑屏障维持因子[11]。本研究显示模型组海马Netrin1 mRNA转录水平和蛋白表达水平都显著高于对照组。推测Netrin1 mRNA在致痫大鼠海马的高表达，可能是机体的自我修复反应，也有可能与癫痫导致的炎症反应有关[12]。

综上所述，氯化锂-匹罗卡品可成功建立大鼠癫痫模型，癫痫大鼠出现再认记忆障碍，同时其海马组织的Netrin1 mRNA转录水平和蛋白表达水平增高，其具体机制尚需进一步研究。