毛细管气相色谱法同时测定盐酸妥洛特罗原料的残留溶剂、杂质与含量

陈子龙，路京，赵丽，吕倩，杜思迪（陕西省渭南市检验检测研究院食品药品检验中心，陕西 渭南 714000）

盐酸妥洛特罗为肾上腺素β受体兴奋剂，对支气管平滑肌具有强而持久的扩张作用，对心脏的兴奋作用较弱，临床适用于缓解支气管哮喘、急慢性支气管炎、肺气肿和尘肺等呼吸道阻塞性症状[1]。其现行标准为国家食品药品监督管理局标准WS-10001-（HD-0558-2002）[2]，在具体操作中存在以下问题：一是现行标准采用薄层色谱法，用2%自身对照检查杂质限度，该方法检测灵敏度低，自身对照的斑点几乎观察不到，且样品斑点在该色谱条件下有拖尾现象，影响结果判定，方法的专属性和准确性较差；二是根据盐酸妥洛特罗原料的生产工艺，其在生产过程中可能使用了乙醇、正己烷、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、1，4-二氧六环、乙酸乙酯、乙酸丁酯等多种有机溶剂，但现行标准仅对乙酸乙酯进行了控制，JPXVⅡ等其他国外现行标准中均未对残留溶剂进行控制；三是含量测定采用以醋酸汞溶液为溶剂的高氯酸非水滴定法，而醋酸汞对环境和人体危害较大，应避免使用。本文参考相关文献[3-14]，建立了毛细管气相色谱法，经方法学验证，对盐酸妥洛特罗原料的7种残留溶剂、杂质邻氯苯乙酮和盐酸妥洛特罗含量同时进行测定，弥补了原标准残留溶剂项组分缺失，杜绝了含量测定的汞污染，还可以对杂质邻氯苯乙酮的残留量进行检测，极大提高了检验效率，可更好地用于本品的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

6890N气相色谱仪（美国安捷伦公司）；XPE-105电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；全自动空气源HA-300型（北京中惠普分析技术研究所）。

1.2 试药

盐酸妥洛特罗对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100472-202002，含量：99.4%），盐酸妥洛特罗原料（某公司，批号：20171001，20171002，20171003，按干燥品计，纯度＞99.0%）；二甲基亚砜、无水乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六环、乙酸丁酯、邻氯苯乙酮（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent DB-624（30 m×320 μm×1.8 μm）毛细管色谱柱，程序升温，起始温度为55℃，维持2 min，以10℃·min－1的速率升温至180℃，再以50℃·min－1的速率升温至240℃，维持10 min；进样口温度240℃；检测器温度250℃，流速1.5 mL·min－1，分流比10∶1，进样体积1 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取无水乙醇247.0 mg、二氯甲烷32.83 mg、甲基叔丁基醚249.9 mg、正己烷14.30 mg、乙酸乙酯248.6 mg、1，4-二氧六环21.16 mg、乙酸丁酯253.4 mg、邻氯苯乙酮53.93 mg，同置100 mL量瓶中，用二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液①；精密称取盐酸妥洛特罗对照品100.23 mg，置10 mL量瓶中，用二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液②；精密量取对照品储备液①和②各1 mL置10 mL量瓶中，用二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。

2.2.2 残留溶剂和邻氯苯乙酮测定供试品溶液精密称取盐酸妥洛特罗样品适量，用二甲基亚砜溶解并稀释制成每1 mL约含50 mg的溶液，即得。

2.2.3 含量测定供试品溶液 精密称取盐酸妥洛特罗样品适量，用二甲基亚砜溶解并稀释制成每1 mL约含1 mg的溶液，即得。

2.3 系统适用性试验

分别取空白溶剂（二甲基亚砜）、对照品溶液和供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果溶剂对测定无干扰，出峰顺序依次为乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六环、乙酸丁酯、邻氯苯乙酮和盐酸妥洛特罗，上述组分与相邻峰分离度均符合要求，色谱图见图1。

图1 气相色谱图Fig 1 GC chromatograms

2.4 线性关系考察

分别精密量取对照品储备液①、②，适量稀释得系列线性溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，以峰面积对对照品溶液质量浓度进行线性回归，得线性方程，结果显示，在各自线性范围内，各组分均与测定值呈良好的线性关系，结果见表1。

表1 各组份的线性、范围、检测限及定量限Tab 1 Linear relationship，range，LOD and LOQ of components

2.5 回收试验

2.5.1 残留溶剂和邻氯苯乙酮测定回收率 精密称取本品约0.5 g，共6份，分别置10 mL量瓶中，精密加入对照品储备液①1 mL，用二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀。取上述溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算回收率，结果乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六环、乙酸丁酯、邻氯苯乙酮的回收率分别为99.8%、98.8%、99.3%、99.0%、99.5%、98.6%、99.2%和100.2%，RSD均＜3.0%。

2.5.2 含量测定回收率 精密称取本品约5 mg，共9份，分别置10 mL量瓶中，分别精密加入对照品储备液②0.3、0.5和0.7 mL，用二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，即得低、中、高3个浓度的加样回收测定样品溶液。取对照品溶液和上述溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算回收率，结果盐酸妥洛特罗低、中、高3个浓度的平均回收率为99.7%、99.8%、99.8%，RSD为0.60%、0.30%、0.40%。

2.6 检测限与定量限

取混合对照品溶液逐步稀释，稀释后的样品按“2.1”项下色谱条件进行分析，得不同组分的定量限和检测限，结果见表1。

2.7 精密度试验

取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，结果乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六环、乙酸丁酯、邻氯苯乙酮和盐酸妥洛特罗的峰面积的RSD分别为1.6%、2.1%、1.9%、1.8%、1.2%、2.2%、1.7%、1.1%和1.0%，表明本方法精密度良好。

2.8 重复性试验

取批号为20171001的样品，分别按“2.2”项下方法制备残留溶剂和杂质测定供试品溶液及含量测定供试品溶液各6份。取对照品溶液和上述溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算样品中残留溶剂、邻氯苯乙酮和盐酸妥洛特罗的含量，结果乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、1，4-二氧六环、乙酸丁酯、邻氯苯乙酮均未检出，乙酸乙酯的含量为0.008%（RSD为2.0%），盐酸妥洛特罗含量为100.0%（RSD为1.3%）。

2.9 稳定性试验

取批号为20171001的样品，分别按“2.2”项下方法制备残留溶剂和杂质供试品溶液及含量测定供试品溶液各1份。分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样分析，结果乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、1，4-二氧六环、乙酸丁酯、邻氯苯乙酮均为未检出，乙酸乙酯峰面积的RSD为1.4%，盐酸妥洛特罗峰面积RSD为1.2%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.10 耐用性试验

耐用性试验结果表明，采用不同品牌极性相同的色谱柱[Agilent DB-624（30 m×530 μm×3.0 μm），Agilent DB-624（30 m×320 μm×1.8 μm）；DIKMA DB-624（30 m×250 μm×1.4 μm）]，适当改变载气流速和柱温，均可满足系统适应性试验要求。

2.11 样品测定

取3批样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，结果3批样品中残留溶剂乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、1，4-二氧六环、乙酸丁酯均未检出；3批样品中乙酸乙酯的含量分别为0.008%、0.004%和0.004%，均符合《中国药典》（2020年版四部0861）残留溶剂的限度要求；邻氯苯乙酮均未检出；盐酸妥洛特罗含量与现行标准（采用高氯酸非水滴定法测定）结果基本一致，见表2。

表2 不同方法测定盐酸妥洛特罗含量结果 (%)Tab 2 Determination of tulobuterol hydrochloride by different methods (%)

3 讨论

3.1 邻氯苯乙酮限度的确定

邻氯苯乙酮为无色油状液体，吞食有害，刺激眼睛、呼吸系统和皮肤。被国际癌症研究机构（IARC）鉴别为可能的或肯定的人类致癌物，半致死剂量（LD50）为1.820 mg·kg－1（经口-大鼠），结合本品推荐的最大治疗剂量，推算出本品中邻氯苯乙酮的理论限度为9.1%，本方法拟定限度为0.1%，远低于理论杂质限度。

3.2 溶剂的选择

根据盐酸妥洛特罗的溶解性试验可知，本品在水、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜中易溶，因正己烷等待测组分在水中不溶，因此对甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜等4种溶剂进行了试验，发现二甲基亚砜作为溶剂，各组分峰形良好，灵敏度高，因此选择二甲基亚砜为溶剂。

3.3 色谱条件的优化

由于待测的9个组分中，二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷沸点与极性相近，分离难度大，同时全部9个组分之间的极性差异大，因此优先选择中等极性的DB-624色谱柱，以兼顾各组分的不同极性。试验过程中也考察了非极性的DB-1和极性的DB-WAX色谱柱，结果表明各组分的分离和色谱峰的对称性均不如DB-624色谱柱。

在梯度洗脱程序的优化过程中，考虑到各组分沸点各不相同，跨度大，从最低的39.8℃（二氯甲烷）到264.2℃（盐酸妥洛特罗）。因此选择较低的起始温度和升温速率，确保沸点较低的7种残留溶剂分离良好，然后以较快的升温速率迅速升温至240℃并维持10 min，使溶剂和其他信号杂质在坡度基线出峰，待测的邻氯苯乙酮和盐酸妥洛特罗在基线平稳处出峰。此外，在确保各组分分离度符合要求的前提下，适当提高流速至1.5 mL·min－1，以缩短进样分析时间，提高工作效率。