基于HIF-1α/Beclin1/LC3-Ⅱ信号通路探讨油桐花水提物对烫伤大鼠的作用机制

彭健，王永萍，刘欣（贵州中医药大学 基础医学院，贵阳 550002）

烧烫伤是指人们在生活或工作中被沸水、油烫伤，或者是被火、电、化学药物等灼烧，引起皮肤起泡或深层组织感染、溃烂、形成瘢痕的外伤病[1]。研究表明，缺氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factors-1α，HIF-1α）、Beclin1蛋白及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）的表达与烫伤病理发展密切相关。HIF-1α是感应细胞内氧气浓度的最敏感因子，细胞缺氧程度常用HIF-1α的表达表示，且与自噬表达程度密切相关[2-3]。烫伤后HIF-1α表达增多，使大量Beclin1蛋白质释放形成自噬泡，诱导大量LC3-Ⅱ合成，导致自噬水平上升[4-6]。Beclin1、LC3-Ⅱ是反映自噬活性的标志性蛋白。中医认为烧烫伤属于“火毒、热毒”，常因火毒热气内攻，致皮肉溃烂，加重病情[7]。油桐为落叶性乔木，属大戟科油桐属，油桐花是蔷薇亚纲，大戟科植物油桐[Vernicia fordii（Hemsl.）Airy Shaw]的花，主产于我国南方地区，油桐全株皆可入药，但其根、皮、叶、果实均有毒，临床应用很少。油桐花毒性较小，归肺、心经，具有促进伤口愈合、消肿、镇痛、止血、麻醉等作用[8]，古人早已用其治疗烧烫伤，疗效显著。本实验拟通过油桐花水提物调控HIF-1α/Beclin1/LC3-Ⅱ信号通路的表达来研究油桐花治疗烫伤的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级Wistar雄性大鼠60只，体质量（150±15）g [长沙天勤生物公司，动物许可证：SCXK（湘）2019-0013；实验动物合格证编号：No.1107262011001163]。

1.2 试药

硫化钠（批号：20191210，国药集团），湿润烧伤膏（批号：13923911455，汕头美宝制药），苏木素染液（批号：C200301）、伊红染液（批号：C200403）（珠海贝索生物），Beclin1、HIF-1α、LC3-Ⅱ ELISA试剂盒（批号分别为ml059015、ml003167、ml059507，上海酶联生物）。Beclin1、HIF-1α、LC3B抗体（批号分别为11306-1-ap、AF1009、AF5402，Affinity）。β-actin抗体（批号：AC026，Abclonal），生物素化山羊抗兔IgG（H＋L）（批号：ab6721，英国Abcam）。Prime Script RT reagent Kit（货号RR047A，宝日生物）。

1.3 仪器

QE-300目中药粉粹机（浙江屹立），DRHH-S8型恒温水浴锅（上海双捷），CTP0011型电子天平（上海友声衡器），YLS-5Q型烫伤仪（山东益延科技），KD-BM型包埋机（浙江金华科迪），YD-335型石蜡切片机（浙江金华设备厂），JY-SCZ4＋型垂直电泳槽（北京君意公司），5200型化学发光凝胶成像仪（上海天能科技）。

1.4 药材

新鲜油桐花采自四川省峨眉山市黄湾镇，花和蒂一并采摘，由贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为正品。日光下晒干，用粉碎机粉碎，装入密封塑料袋，备用。前期课题组研究证明油桐花不同溶剂提取物均有一定的抗炎作用，但以水提物抗炎镇痛作用更明显[9]，因此本实验采用油桐花水提物进行后续研究。

2 方法

2.1 油桐花水提物制备

精取油桐花粉末30 g，装入盛有300 mL蒸馏水的圆底烧瓶，浸泡30 min，恒温水浴锅加热回流2 h，纱布过滤3次，并将纱布中残留的液体压出，即得油桐花水提物，质量浓度为0.1 g·mL－1（即低剂量0.33 g·kg－1）。将油桐花水提物倒入蒸发皿中，电炉加热浓缩，制得质量浓度为0.6 g·mL－1、0.3 g·mL－1的油桐花水提物（即高剂量2 g·kg－1，中剂量1 g·kg－1[8]）。

2.2 动物造模及给药

参考课题组前期研究[9-10]，大鼠随机分为正常组（n＝10）和造模组（n＝50），适应喂养7 d。20%硫化钠脱背毛，24 h后造模大鼠腹腔注射10%水合氯醛，充分麻醉后标记烫伤位置，为两耳连线中点后5 cm。YLS-5Q控温烫伤仪设置温度120℃，实际温度约90℃，3#烫头（2.5 cm2）紧贴皮肤烫伤18 s。烫伤前设置空调温度26℃，防止大鼠体温过低而死亡。烫伤3 d后，随机选取模型大鼠1只剪取烫伤全层皮肤，放入4%多聚甲醛溶液固定，做HE染色对比。造模成功病理切片可见表皮和真皮大面积坏死，皮下肌纤维变性坏死，炎性细胞浸润，出血等一系列病理改变（见图1）。造模成功后再分为模型组，阳性组（湿润烧伤膏组），油桐花水提物高、中、低剂量组，每组10只，用记号笔标记。油桐花水提物各剂量组分别用棉签蘸取油桐花水提物2、1、0.33 g·kg－1对大鼠创面进行均匀涂抹。阳性组用棉签蘸取湿润烧伤膏均匀涂抹，剂量0.13 g·kg－1，连续21 d，1次·d－1。正常组和模型组不给药。

图1 大鼠造模前后皮肤组织形态学变化（HE，200×）Fig 1 Histomorphological change of the rat skin before and after modeling（HE，200×）

2.3 取材

用药21 d后对各组大鼠背部进行图片采集。股静脉取血，3000 r·min－1离心15 min，取上清液，于－80℃保存。剪取正常组皮肤及各烫伤组烫伤全层皮肤组织，一半放入4%多聚甲醛固定，另一半于－80℃储存，备用。

2.4 指标检测

药物干预21 d后，油桐花水提物对烫伤大鼠创面愈合的影响可用创面大体图片、面积及损伤皮肤HE染色来评价。用ELISA法检测血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ的浓度水平，蛋白质印迹法、免疫组化检测皮肤HIF-1α、Beclin1和LC3-Ⅱ的蛋白质表达水平。

2.5 统计学分析

使用SPSS 25.0统计分析，数据以±s表示，采用组间均数比较的方法ANOVA，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对大鼠烫伤创面的影响

烫伤大鼠创面恢复图片见图2，与模型组比较，不同剂量油桐花水提物和湿润烧伤膏对大鼠烫伤创面恢复有明显效果，伤口明显减小。

图2 油桐花水提物对烫伤大鼠创面的影响Fig 2 Effect of aqueous extract of Tung flower on scalded wound in scalded rats

3.2 大鼠皮肤组织形态学变化

大鼠皮肤HE染色显示，正常皮肤组织表皮结构完整清晰，角化层明显，复层扁平上皮层较薄，细胞排列整齐紧密；真皮内胶原纤维排列整齐，胞质红染、均匀；皮下脂肪层及肌层结构清晰可见，脂肪细胞及肌纤维排列整齐、致密，体积大小均一，细胞核形态正常。模型组皮肤有大批纤维组织增生及炎性细胞，大批皮下组织变性、坏死。与模型组相比，阳性组和高剂量组皮肤组织损伤区域可见部分胶原纤维交错排列和较多的纤维细胞，少量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，提示皮肤组织损伤修复程度相对最好；低剂量组和中剂量组皮肤组织损伤区域可见较多的纤维细胞，炎性细胞较少，提示皮肤组织损伤修复程度相对较好（见图3）。

图3 油桐花水提物对烫伤大鼠皮肤组织病理变化的影响（HE，400×）Fig 3 Effect of aqueous extract of Tung flower on the pathological change of the skin tissue in scalded rats（HE，400×）

3.3 免疫组化检测结果

与正常组相比，模型组大鼠皮肤组织HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ表达显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，阳性组，油桐花水提取物高、中剂量组大鼠皮肤组织HIF-1α也明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；阳性组和低剂量组大鼠皮肤组织Beclin1蛋白含量显著降低（P＜0.01）；高、中剂量组大鼠皮肤组织Beclin1蛋白含量降低（P＜0.05）；各剂量组及阳性组大鼠皮肤组织LC3-Ⅱ蛋白含量均不同程度降低（P＜0.05）。见表1及图4。提示油桐花水提物能降低烫伤大鼠皮肤中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ 的活性表达。

图4 油桐花水提物对烫伤大鼠皮肤组织HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ表达的影响（免疫组化，400×）Fig 4 Effect of aqueous extract of Tung flower on HIF-1α，Beclin1，LC3-Ⅱ expression in the skin tissue of scalded rats（immunohistochemistry，400×）

表1 油桐花水提物对烫伤大鼠皮肤中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ表达的影响(±s，n＝10)Tab 1 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α，Beclin1 and LC3-Ⅱ in the of skin scalded rat (x± s，n＝10)

表1 油桐花水提物对烫伤大鼠皮肤中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ表达的影响(±s，n＝10)Tab 1 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α，Beclin1 and LC3-Ⅱ in the of skin scalded rat (x± s，n＝10)

注（Note）：与正常组相比，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01（Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01）。

组别 HIF-1α Beclin1 LC3-Ⅱ正常组 0.2019±0.0042 0.2146±0.0061 0.2110±0.0062模型组 0.2240±0.0119**0.2401±0.0141**0.2355±0.0067**阳性组 0.2025±0.0046##0.2122±0.0063##0.2170±0.0147#高剂量组 0.2037±0.0014# 0.2176±0.0031# 0.2190±0.0025#中剂量组 0.2044±0.0080# 0.2207±0.0095# 0.2179±0.0062#低剂量组 0.2189±0.0124 0.2157±0.0111##0.2201±0.0037#

3.4 对大鼠血清HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ浓度的影响

由表2可知，与正常组比较，模型组血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ浓度明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，阳性组与油桐花水提物高、中剂量组大鼠血清中HIF-1α浓度明显降低（P＜0.05）；阳性组，油桐花水提物各剂量组血清中Beclin1浓度降低（P＜0.05，P＜0.01）；阳性组，油桐花水提物高、中剂量组的大鼠血清中LC3-Ⅱ 浓度降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示油桐花水提物能抑制烫伤大鼠血清HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ的表达。

表2 油桐花水提物对烫伤大鼠血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ浓度的影响(±s，n＝10)Tab 2 Effect of aqueous extract of Tung flower on the concentration of HIF-1 α，Beclin1 and LC3-Ⅱ in the serum of scalded rats(±s，n＝10)

表2 油桐花水提物对烫伤大鼠血清中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ浓度的影响(±s，n＝10)Tab 2 Effect of aqueous extract of Tung flower on the concentration of HIF-1 α，Beclin1 and LC3-Ⅱ in the serum of scalded rats(±s，n＝10)

注（Note）：与正常组相比，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01（Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01）。

组别 HIF-1α/（pg·mL－1）LC3-Ⅱ/（pg·mL－1）正常组 51.326±1.875 9.191±0.646 742.507±58.647模型组 56.070±2.570** 11.338±0.645** 876.069±60.161**阳性组 52.286±3.670# 9.677±0.565## 760.148±52.932##高剂量组 51.980±3.189# 9.990±1.144# 764.556±63.867##中剂量组 52.403±2.469# 10.128±1.087# 779.019±65.049#低剂量组 54.560±2.238 9.966±0.875# 838.497±58.231 Beclin1/（ng·mL－1）

3.5 皮肤组织蛋白质印迹法检测HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ表达情况

模型组大鼠皮肤中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达均显著高于正常组（P＜0.01）。给药21 d后，与模型组相比，各组大鼠皮肤中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示油桐花水提物能降低烫伤大鼠皮肤中HIF-1α、Beclin1及LC3-Ⅱ 的蛋白表达，见表3及图5。

图5 油桐花水提物对烫伤大鼠皮肤中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达影响Fig 5 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1 α，Beclin1 and LC3-Ⅱ protein in the skin of scalded rat

表3 油桐花水提物对烫伤大鼠皮肤中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达影响(±s，n＝10)Tab 3 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α，Beclin1 and LC3-Ⅱ protein in the skin of scalded rat(±s，n＝10)

表3 油桐花水提物对烫伤大鼠皮肤中HIF-1α、Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达影响(±s，n＝10)Tab 3 Effect of aqueous extract of Tung flower on the expression of HIF-1α，Beclin1 and LC3-Ⅱ protein in the skin of scalded rat(±s，n＝10)

注（Note）：与正常组相比，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01（Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01）。

LC3-Ⅱ/（pg·mL－1）正常组 1.0000±0.0000 1.0000±0.0000 1.0000±0.0000模型组 1.6349±0.0949**1.8725±0.3075**2.2788±0.5448**阳性组 1.1659±0.0385##1.3667±0.1973##1.5265±0.2533#高剂量组 1.2659±0.0790##1.1412±0.0631##1.4509±0.4272#中剂量组 1.3620±0.1447##1.3718±0.1261##1.6267±0.2611#低剂量组 1.4574±0.0862# 1.4910±0.0923# 1.6499±0.2459#组别 HIF-1α/（pg·mL－1）Beclin1/（ng·mL－1）

4 讨论

本课题组前期已掌握了油桐花水提物制备方法，发现其水提物的效果最优。烧烫伤是由外部热力致皮肤组织损伤，进而缺血缺氧，变性坏死的疾病[11]，组织细胞缺氧与自噬是其损伤的两大靶点。本研究通过油桐花水提物外用直接干预其信号通路上的关键蛋白治疗烫伤。

组织缺氧程度常用HIF-1α表达水平表示，检测自噬活性常选用Beclin1、LC3-Ⅱ 作为目标蛋白。研究表明，下调HIF-1α可抑制Beclin1、LC3-Ⅱ 表达[12]，实验及临床中常通过调控这3种因子表达来达到治疗目的[12]。用药干预后HE染色结果证明，油桐花水提物可促进烫伤皮肤组织损伤修复。从创面恢复图片、创面大小、HE染色结果看，油桐花水提物治疗烫伤疗效是肯定的。免疫组化、ELISA、Western blot等检测结果提示油桐花水提物可通过调控缺氧与自噬信号通路治疗烫伤。

综上，大鼠皮肤烫伤会导致皮肤组织细胞缺氧[13]，自噬增强。油桐花水提物可抑制HIF-1α/Beclin1/LC3-Ⅱ信号通路开放，缓解烫伤大鼠皮肤组织缺氧，抑制细胞过度自噬而带来的损伤，恢复烫伤创面，与阳性药物湿润烧伤膏的作用相似。本实验为后续研究油桐花水提物其他作用机制与临床开发应用奠定了一定基础。