新型冠状病毒灭活方式对化学发光微粒子免疫检测法监测环孢素血药浓度的影响

缪文清，石晨阳，尹悦勤，赵霖蔓，范国荣*（. 上海交通大学附属第一人民医院临床药学科，上海00080；. 上海健康医学院药学院，上海 08；. 重庆医科大学药学院，重庆 40006）

新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎，COVID-19）在世界各地流行蔓延，并出现多种变异的新型冠状病毒（简称新冠病毒，SARSCoV-2），疫情防控形势十分严峻。

环孢素是一种真菌源性的环状十一氨基酸多肽，是器官移植后免疫抑制治疗的主要药物[1-2]，可以大大提高移植器官如心脏、肝脏、肾脏的存活率[3-5]。环孢素的血药浓度监测有助于调整剂量，以避免剂量不足导致治疗无效或过量而中毒。环孢素会引起严重的不良反应，主要是肾毒性和肝毒性[6]，还包括腹泻、牙龈增生、恶心、呕吐等。多项研究表明对环孢素的浓度进行监测，根据血药浓度来制订个体化给药方案有良好效果[7]。

新冠肺炎疫情期间，环孢素血液检测样本可能来源于无症状感染者、疑似患者或确诊患者，这对于从事血药浓度检测的医务工作者来说，存在暴露于新冠病毒环境甚至感染新冠病毒的危险性。因此，为了确保检测人员的安全，需要在血样检测前按照《新型冠状病毒肺炎患者血药浓度检测技术指引》中的要求对标本进行病毒灭活[8]，根据新冠病毒的理化特性，其对紫外线和热敏感，56℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶性溶剂均可有效灭活病毒[9]。目前指南推荐的对于生物标本的消毒方法为湿热法和紫外消毒法，但是56℃水浴30 min和紫外线照射两种病毒灭活方式对化学发光微粒子免疫检测法（CMIA）监测环孢素血药浓度是否有影响，热灭活和紫外线照射预处理的环孢素血样标本是否还能满足检测的要求，是否会对血样标本中被检测的环孢素产生破坏从而影响检测结果的准确性等未见报道。基于此，本研究考察了新冠病毒热灭活和紫外线照射灭活两种方式对CMIA检测环孢素血药浓度的影响。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

收集本院移植患者环孢素血药浓度检测标本180例，随机选取20例测定溶血前后环孢素血药浓度，80例测定热灭活前后环孢素血药浓度，80例测定紫外线照射灭活前后环孢素血药浓度。另配制10份环孢素标准溶液分别测定热灭活前后环孢素标准液浓度。

1.2 仪器与试药

ARCHITECT i1000SR 全自动免疫分析仪（美国雅培），DK-S24型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），GB19258-2012紫外线杀菌灯（东莞市毅万光源有限公司），Vortex-Genie 2涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司），移液枪（德国Eppendorf公司），高速离心机（德国Eppendorf公司）。环孢素测定试剂盒（批号：07001M800）、环孢素校准品（批号：85K27620）（美国雅培公司）和质控液（泰克帕斯诊断产品有限公司，批号：02111190）。环孢素注射液（诺华制药，规格：5 mL/250 mg，批号：SXH60）。

1.3 试验方法

1.3.1 环孢素血药浓度测定方法 采用CMIA测定标本热灭活前后，紫外线照射灭活前后环孢素血药浓度以及环孢素标准溶液浓度，试剂盒检测范围为30.0～1500.0 ng·mL－1。环孢素标本前处理标准操作规程如下：标本轻轻上下颠倒混匀10次，混匀后用移液枪精密吸取200 μL至离心管中，在每份含有待测样本的离心管中分别加入环孢素全血溶解剂100 μL，环孢素全血沉淀剂400 μL，盖紧离心管后用涡旋振荡器，涡旋5～10 s充分混匀，用高速离心机13 000 r·min－1离心4 min，将上清液倒入移植预处理管中，再用涡旋振荡器，涡旋5～10 s，上机检测。检测结束后用含氯消毒剂对仪器探针、管路等进行清洗维护。

1.3.2 溶血实验方法 于患者再次服药前，用EDTA抗凝管抽取静脉血大约5 mL，均匀混合后从中取出1 mL血样标本置于离心管内，用涡旋振荡器强力涡旋1 min引起机械性溶血。

1.3.3 热灭活方法 于患者再次服药前，用EDTA抗凝管抽取静脉血大约5 mL，均匀混合后从中取出1 mL血样标本置于离心管内，经热灭活处理。根据中华医学会检验学分会要求，标本热灭活条件为56℃水浴30 min[10]。在通风橱或有条件的实验室可在生物安全柜内，用75%乙醇对标本采集管外周进行喷洒消毒，用吸水纸擦拭后放入56℃水浴锅中，为防止标本采集管漂浮，放置重物于标本盖上，每隔5～10 min将血样标本摇匀1次，使标本热灭活时受热均匀。

1.3.4 紫外线照射灭活方法 于患者再次服药前，用EDTA抗凝管抽取静脉血大约5 mL，均匀混合后从中取出1 mL置于透明离心管内，于254 nm紫外线灯下放置30 min。

1.3.5 热灭活处理 取浓度为50 mg·mL－1环孢素注射液，加入生理盐水稀释成500 ng·mL－1的环孢素标准溶液，取10份500 ng·mL－1的环孢素标准溶液按照“1.3.3”项下方法56℃水浴30 min，另取10份500 ng·mL－1的环孢素标准溶液不做热灭活处理。然后均按照“1.3.1”项下方法测定环孢素标准液浓度。

1.4 统计学处理方法

应用SPSS 25.0统计分析软件对实验数据进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组数据间采用配对t检验，分析溶血前后、环孢素血样标本和标准液热灭活前后、紫外线照射前后环孢素血药浓度结果，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 溶血前后环孢素血药浓度检测结果

采用化学发光微粒子免疫分析法检测20例溶血前后环孢素血药浓度，结果溶血前环孢素平均血药浓度为（279.71±100.66）ng·mL－1，最低血药浓度为103.30 ng·mL－1，最高血药浓度为451.90 ng·mL－1；溶血后环孢素平均血药浓度为（276.92±98.29）ng·mL－1，最低血药浓度为132.90 ng·mL－1，最高血药浓度为464.30 ng·mL－1，溶血前后环孢素血药浓度差异无统计学意义（P＝0.649），见表1。

2.2 热灭活前后环孢素标准液浓度检测结果

采用化学发光微粒子免疫分析法检测10例热灭活（水浴加热56℃ 30 min）前后环孢素标准液浓度（质量浓度为500 ng·mL－1），热灭活前环孢素标准液平均浓度为（499.42±2.35）ng·mL－1，最低浓度为495.80 ng·mL－1，最高浓度为502.40 ng·mL－1；热灭活后平均浓度为（467.14±4.03）ng·mL－1，最低浓度为461.80 ng·mL－1，最高浓度为472.80 ng·mL－1；采用配对t检验进行数据统计分析，表明热灭活前后环孢素标准液质量浓度差异有统计学意义（P＝0.002），并且热灭活后环孢素标准液浓度普遍降低。

2.3 热灭活前后环孢素血药浓度检测结果

采用CMIA检测80例热灭活（水浴加热56℃ 30 min）前后环孢素血药浓度，热灭活前环孢素平均血药浓度为（335.64±143.89）ng·mL－1，最低血药浓度为140.80 ng·mL－1，最高血药浓度为987.50 ng·mL－1；热灭活后环孢素平均血药浓度为（320.62±133.75）ng·mL－1，最低血药浓度为129.30 ng·mL－1，最高血药浓度为946.90 ng·mL－1；采用配对t检验进行数据统计分析，表明热灭活前后环孢素血药浓度差异有统计学意义（P＝0.010），并且热灭活后环孢素血药浓度普遍降低，见表1。

2.4 紫外线照射灭活前和紫外线照射灭活后环孢素血药浓度检测结果

采用CMIA检测80例紫外线照射灭活（254 nm 30 min）前后环孢素血药浓度中，紫外线照射灭活前环孢素平均血药浓度为（344.83±131.81）ng·mL－1，最低血药浓度为162.30 ng·mL－1，最高血药浓度为851.60 ng·mL－1；紫外线照射灭活后环孢素平均血药浓度为（349.91±130.68）ng·mL－1，最低血药浓度为180.80 ng·mL－1，最高血药浓度为853.80 ng·mL－1；采用配对t检验进行数据统计分析，表明紫外线照射灭活前后环孢素血药浓度差异无统计学意义（P＝0.139），见表1。

表1 不同处理方式环孢素血药浓度变化情况Tab 1 Cyclosporine blood concentration under diffenent inactivation condition

3 讨论

3.1 溶血前后环孢素血药浓度变化情况分析

溶血是指红细胞破裂，血红蛋白逸出到血浆中，可由多种理化因素和毒素引起，高温、低渗溶液、机械性强力振荡、突然低温冷冻（－20～－25℃）、过酸、过碱等均可引起溶血。红细胞遇高温后其细胞膜破裂，因此热灭活（56℃30 min）不可避免地会引起标本溶血。本研究中所有标本热灭活后均发生溶血，因此需要考察溶血后是否会对环孢素血药浓度检测结果造成影响，以排除和规避是溶血造成的环孢素血药浓度的增加或降低；进一步也可以为后续热灭活试验确定环孢素对热是否稳定排除溶血因素。本研究采用涡旋振荡器强力涡旋1 min引起机械性溶血建立溶血模型模拟溶血，考察溶血前后环孢素血药浓度变化情况。结果表明，溶血前后环孢素血药浓度差异无统计学意义（P＝0.649），因此，可以排除标本溶血对环孢素血药浓度的影响。由于CMIA采用两步法免疫检测，运用Chemiflex技术，样本中的环孢素A与环孢素A抗体包被的微粒子结合，再和吖啶酯标记的环孢素A结合物形成反应混合物，最后通过加入激发液和预激发液产生的化学发光反应以相对发光单位的数值（RLU）来测量[11]，溶血释放的血红蛋白不能作为抗原竞争免疫结合，因此，溶血现象不会影响环孢素血药浓度测定结果。

3.2 热灭活前后环孢素标准溶液和环孢素血药浓度变化情况分析

80例热灭活环孢素血药浓度中，环孢素血药浓度降低的占75.0%（60例），差值在－195.9～184.6 ng·mL－1，中位数为－10.6 ng·mL－1，血药浓度变化范围在－32.5%～ 14.9%，热灭活前后环孢素血药浓度变化结果见图1。由于环孢素标准溶液水浴加热56℃ 30 min后浓度也下降，可得知环孢素在56℃水浴30 min不稳定，会引起环孢素的降解，且已排除标本溶血对环孢素血药浓度监测的影响，因此，热灭活后环孢素血药浓度降低的主要原因可能是湿热法在灭活所有脂包膜病毒和大部分非脂包膜病毒的同时，使环孢素受热分解引起的。

图1 热灭活前后环孢素血药浓度结果变化图（虚线表示浓度变化下降超过15%）Fig 1 Changes in the blood concentration of cyclosporine before and after the thermal inactivation（the dotted indicates concentration decrease by more than 15%）

根据《中国药典》关于原料药物与制剂稳定性试验指导原则，其含量变化值允许在±5%范围内[12]，本研究中热灭活后环孢素标准溶液浓度变化范围在－7.28%～5.89%，已超过允许范围；根据药典关于生物样品定量分析的指导原则，其含量变化值允许在±15%范围内[12]，本研究中热灭活后环孢素血药浓度变化范围在－32.5%～14.9%，已超过允许范围。本研究发现无论是环孢素标准溶液还是环孢素血液检测标本，热灭活后环孢素浓度均有不同程度的下降，而且都超过药典规定的范围，根据环孢素热灭活后的检测结果调整临床用药，会对移植患者环孢素的使用方案造成误导，甚至使病情恶化。因此，新冠肺炎疫情期间，不建议对环孢素检测标本热灭活处理后再进行血药浓度检测。

3.3 紫外线照射灭活前后环孢素血药浓度变化情况分析

采用CMIA检测80例紫外线照射灭活前后环孢素血药浓度，结果表明，紫外线照射灭活前后环孢素血药浓度结果未见明显变化。因此，建议对环孢素血药浓度检测标本紫外线照射灭活处理后再进行常规检测。

紫外线照射灭活如果没有防护措施，极易对人体造成巨大伤害。如果裸露的肌肤被这类紫外线灯照射，轻者会出现红肿、疼痒、脱屑；重者甚至会引发癌变、皮肤肿瘤等。同时，它也是眼睛的“隐形杀手”，会引起结膜、角膜发炎，长期照射可能会导致白内障，因此在研究过程中检测人员需要注意紫外线防护。

综上所述，CMIA检测COVID-19确诊患者或者疑似患者的环孢素血药浓度，不可用湿热法56℃水浴30 min灭活样本，可用254 nm紫外线照射30 min灭活临床血液检测标本，以降低血样检验人员感染病毒风险。