肝癌组织HBx和ANGPTL4表达及与临床病理、预后的关系

马 艳，黎 蓓，李 盈，程志祥

据流行病学调查显示，我国肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma， HCC)发生率在恶性肿瘤中位居第四，病死率位居第三，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)感染是HCC发生的主要原因[1]。目前HCC首选肝切除术等手术治疗，但部分晚期患者无手术适应证，部分早期患者术后仍有较高的复发率，预后较差，因此寻找肝癌治疗的靶点及预测患者预后的标志物对临床治疗意义重大。HBV感染是HCC发生的独立危险因素，其调控的相关基因的变化可能与HCC的发生密切相关。HBVx蛋白(HBx)是HBV开放编码框编码的病毒蛋白，可与宿主相关因子结合，调节细胞信号转导、增殖、凋亡、转移等生理过程；另外，HBx也可通过调节多种信号转导通路改变细胞的生物学行为[2-3]。HCC作为一种富供血恶性肿瘤，其发生及发展均与血管生成密切相关，血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)是一种具有多种生物学活性的细胞因子，可参与脂代谢、细胞分化、能量平衡、炎症等过程；另外，其与血管生成素作用类似，具有调节血管生成的作用[4]。目前已有对HBx、ANGPTL4与HCC的关系研究，但多数集中于体外细胞或血清学方面[5-6]，组织学方面的研究较为缺乏，且较少探讨其与临床病理的关系。本研究以HBV相关性HCC患者组织标本作为研究样本，分析其与癌旁组织HBx、ANGPTL4表达的差异及与临床病理参数的相关性，旨在为HCC患者的病情评估、预后预测提供一定指导，也为HCC的靶向治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取我院2014年12月—2017年3月98例HBV相关性HCC患者经手术切除的肝癌组织标本为研究对象。均经病理证实，术前未接受放化疗及其他辅助治疗措施，病历资料完整。98例中男59例，女39例；年龄33～72(56.47±7.82)岁；存在包膜侵犯者39例；临床分期为Ⅰ期20例，Ⅱ期44例，Ⅲ期22例，Ⅳ期12例；低分化38例，中高分化60例；有远处转移者41例。另择50例距肿瘤切缘5 cm以上的癌旁正常肝组织为癌旁组织，其中男33例，女17例；年龄31～70(56.12±7.89)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1标本处理及石蜡切片制作：新鲜标本采用甲醛溶液固定，经流水洗涤、梯度乙醇逐级脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋制作成石蜡包埋块；采用切片机进行连续切片，切片厚度为4 μm，挑取完好的组织切片进行展片、贴片。

1.2.2免疫组织化学(SP)法：石蜡切片脱蜡、梯度乙醇逐级水化，PBS浸洗后以3%过氧化氢(H2O2)去离子水处理，PBS浸洗后用0.01 mol/L柠檬酸缓冲液煮沸，PBS浸洗后加入山羊血清封闭液孵育15 min，滴加一抗[鼠抗人HBx单克隆抗体(1∶400)；兔抗人ANGPTL4多克隆抗体(1∶200)；以PBS替代一抗作为阴性对照]，PBS浸洗后加入生物素标记的二抗孵育1 h(37 ℃)，PBS浸洗后滴加SP溶液孵育1 h(37 ℃)，PBS浸洗后加入DAB溶液显色，镜检显色满意后流水冲洗，苏木精复染30 s，盐酸乙醇分化3 s，流水冲洗10 min，返蓝后流水冲洗，经常规脱水、透明后封片。

1.2.3图像分析：光学显微镜下阅片，每张切片随机选择5个高倍镜视野，根据视野内阳性细胞百分比及染色强弱进行半定量评分。HBx、ANGPTL4阳性为胞膜、胞浆或胞核出现黄染颗粒。染色细胞数量阳性细胞<5%为0分，阳性细胞5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，≥75%为4分。染色强度：不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两者乘积0～3分为阴性(-)，4～6分为弱阳性(+)，7～9分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)，3分以上为阳性(+)。

2 结果

2.1HBx、ANGPTL4蛋白表达比较 与癌旁组织比较，肝癌组织HBx表达阳性率降低，ANGPTL4表达阳性率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 肝癌及癌旁组织HBx、ANGPTL4表达情况[例(%)]

2.2HBx、ANGPTL4表达与临床参数的关系 肝癌患者HBx和ANGPTL4表达情况与性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、甲胎蛋白(AFP)无关(P>0.05)，与包膜侵犯、门静脉浸润、远处转移等相关(P<0.05，P<0.01);肝癌患者ANGPTL4表达与临床分期有关(P<0.01),而HBx表达与临床分期无关(P>0.05)。见表2。

表2 肝癌患者HBx、ANGPTL4表达与临床病理参数的关系[例(%)]

2.3HBx、ANGPTL4表达与肝癌预后的关系 肝癌患者随访时间为7～58个月，Kaplan-Meier生存曲线及Log-rank检验显示HBx、ANGPTL4阳性患者生存率低于阴性患者(P<0.05)。见图1、2。

图1 HBx阳性及阴性肝癌患者Kaplan-Meier生存曲线比较HBx为乙型肝炎病毒x蛋白

2.4肝癌预后因素分析 COX单因素分析及多因素分析示，肝癌患者包膜侵犯、门静脉浸润、临床分期、远处转移、HBx和ANGPTL4蛋白表达情况是影响预后的因素(P<0.05,P<0.01)。见表3。

表3 98例肝癌患者预后影响因素的COX单因素及多因素分析

3 讨论

HBx是HBV编码的一种病毒蛋白，该基因位于病毒基因组核心区上游，其编码的蛋白质有154个氨基酸，目前认为，HBx虽不能直接作用于宿主DNA序列，但可通过激活其他蛋白分子并促进后者结合到宿主启动子、增强子等结构发挥生物学效应[7]。研究表明，在HBV相关性HCC中，HBx可通过结合到P53蛋白末端，阻碍其抗凋亡作用及修复功能，干扰对异常细胞的抑制作用，促进肿瘤的发生[8]；另外，临床研究也证实HBx的表达与肝癌新生血管生成关系密切，参与多种血管生成的信号通路及细胞调控作用[9]。本研究结果显示，肝癌组织HBx阳性率低于癌旁组织，与既往文献类似[10-11]。有学者认为，癌旁组织HBx表达较癌组织较高的原因可能是HBV感染状态下基因与宿主基因嵌合到癌细胞DNA内，通过突变、缺失等作用使特异性标志物减少，这一改变也可帮助肿瘤细胞逃避免疫监视，从而更快发展及增殖[12]。本研究结果显示，HBx阳性表达的患者具有更高的包膜侵犯率、远处转移率，提示HBx阳性表达与肝癌的发展相关。

ANGPTL4是血管生成素样蛋白家族成员，广泛表达于血管系统及内脏脂肪组织中。目前认为ANGPTL4可参与调控肿瘤形成，另外ANGPTL4作为一个与血管生成密切相关的基因，与肿瘤血管生成有调节作用[13]。本研究结果显示，与癌旁组织相比，肝癌组织ANGPTL4阳性表达率更高，且与包膜侵犯、门静脉浸润、临床分期及远处转移等临床参数相关。既往关于ANGPTL4在肝癌中的表达研究不多，刘凯歌等[14]研究结果显示ANGPTL4在肝癌组织中的阳性表达率为63.76%，与门静脉侵袭、淋巴结转移及临床分期显著相关，另外肝癌细胞系ANGPTL4蛋白水平表达也较正常肝细胞系显著升高。本研究与其研究结果类似。

除与临床病理的关系，本研究分析了两种基因与肝癌患者预后的相关性，结果显示，HBx、ANGPTL4阳性表达的患者预后更差，分析其原因：一方面肝癌作为一种血管相关性肿瘤，血管新生程度与肿瘤侵袭性密切相关，HBx、ANGPTL4阳性表达者可能具有更快的血管生成速度及更强的侵袭性，治疗后更易复发，预后更差。另一方面，部分分子的表达可能影响放化疗的敏感性，既往研究表明，稳定表达HBx基因的肝癌细胞系对于顺铂敏感性较差，可能为预后较差的重要原因[15]。

综上所述，肝癌组织HBx和ANGPTL4表达与患者临床病理及预后相关，临床可通过检测其表达情况判断患者病情及预后。