空气污染暴露对大鼠呼吸系统炎症反应的影响及机制研究

朱敏立，胡 美，司少艳，李月越，王瑞娟，吴 玮

随着燃料的应用及工业化程度的提高，空气污染是人类必须面对的问题，有研究报道其是造成过早死亡的主要环境因素[1]。研究显示，空气质量指数与儿童鼻炎和咳嗽发生频率增加相关[2]。空气污染物成分十分复杂，主要有一氧化碳(CO)、氮氧化物(NOx)、臭氧(O3)、碳氢化合物、硫氧化物及颗粒物(particulate matter， PM)等。气体污染物和颗粒污染物均可导致机体损伤，但损伤机制尚不明确。本研究中通过将大鼠在实时大气环境、过滤掉空气动力学直径>0.3 μm的细颗粒物的气体环境和洁净级环境中饲养3个月，观察大鼠肺组织病理学变化、支气管肺泡灌洗液中T淋巴细胞亚群及部分炎性因子的变化，探讨空气污染在呼吸系统反应中可能发挥的作用及炎症机制。

1 材料及方法

1.1试剂和主要仪器 PerCP标记抗大鼠CD3抗体、FITC标记抗大鼠CD4抗体、PE标记抗大鼠CD8抗体均为eBioscience公司产品；炎性因子多因子检测试剂盒及MAGPIX多功能液相芯片分析仪均为美国Millipore公司产品；FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品；空气污染物动式暴露舱为济南巨康净化设备有限公司产品，由中国科学院大学生命科学学院提供。

1.2空气质量数据采集 选取2016年12月1日—2017年2月28日空气质量数据，来自国家气象局北京市奥体中心(距离试验中空气采集点2 km处)气象数据监测点官方数据。

1.3动物分组及空气污染暴露方法 SPF级雄性SD大鼠27只，体质量180～200 g，随机分为洁净组、大气组、过滤组，每组9只。将洁净组大鼠放置于SPF动物房内饲养；大气组大鼠放置于空气污染物动式暴露舱，该饲养舱通过管路实时收集外界环境中大气，舱内空气质量等同于外界大气环境；过滤组大鼠放置于空气入口处放置HEPA滤膜的空气污染物动式暴露舱，过滤掉空气动力学直径>0.3 μm的细颗粒物，其他等同于大气组饲养舱。3组大鼠均给予普通饲料喂养，昼夜节律变化为12 h。

1.4标本采集 于2017年3月1日结束空气污染暴露。各组大鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉后，用自制灌洗针将4 ℃生理盐水经右侧主支气管注入右肺组织，行支气管肺泡灌洗，每次灌洗量为3 ml，并反复抽吸，共灌洗3次，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。将BALF收集在无菌离心管中并置于冰上，4 ℃ 1500 r/min离心5 min，收集细胞沉淀用于T淋巴细胞亚群检测；BALF上清冻存于-80 ℃低温冰箱，用于炎性因子分析。

1.5观察指标

1.5.1肺组织病理学观察：取左侧肺脏下叶组织以10%多聚甲醛溶液固定，进行肺组织病理学观察。制备肺组织石蜡切片，进行苏木素-伊红(HE)染色后，通过光学显微镜观察肺组织病理学变化。

1.5.2BALF中炎性因子检测和T淋巴细胞亚群分析：①采用液态悬浮芯片法检测BALF中炎性因子，包括白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-13、IL-17、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，严格按说明书进行操作。②BALF离心，细胞沉淀用100 μl含5%胎牛血清的1640悬浮，采用荧光素标记的抗大鼠CD3+、CD4+、CD8+抗体对细胞进行标记，采用流式细胞仪进行分析，以CD3+ T细胞设门，检测CD4+、CD8+ T细胞的百分比，然后计算CD4+/CD8+比值。

2 结果

2.1空气质量数据 所有大鼠饲养时间为88 d，其中空气质量优良23 d，严重及重度污染41 d，轻中度污染24 d。空气质量指数(AQI)及PM2.5、PM10、CO、NO2、O3、SO2的含量为间隔1 h的动态数据，对数据进行正态性检验显示，各指标均不符合正态分布，以中位数、四分位数、最小值和最大值表示。见表1。

表1 实验期间采集大气实时空气质量数据

2.2大鼠体质量比较 3组大鼠均无意外死亡，体质量分别为洁净组(509.93±22.49)g、大气组(528.50±27.47)g、过滤组(533.67±13.25)g。3组大鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3大鼠肺组织病理比较 洁净组大鼠肺组织肺泡完整，无明显肺泡融合，肺间隔无明显增宽，未见炎性细胞浸润；过滤组大鼠部分肺组织出现肺间隔增宽，炎性细胞浸润，部分肺泡融合、形成肺大泡；大气组大鼠部分肺组织出现肺间隔增宽，炎性细胞浸润，部分肺泡融合、形成肺大泡，程度较过滤组加重。见图1。

图1 不同暴露条件下3组大鼠肺组织病理变化(HE×200)

2.4大鼠BALF中T淋巴细胞水平比较 3组BALF中CD4+细胞水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。与洁净组比较，过滤组和大气组BALF中CD8+水平升高，CD4+/CD8+水平降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，但大气组和过滤组上述指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同暴露条件下3组大鼠BALF中淋巴细胞分类比较

2.5大鼠BALF中炎性因子含量比较 过滤组和大气组BALF中IL-1β、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α含量均显著高于洁净组(P<0.01)，但过滤组和大气组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同暴露条件下3组大鼠BALF中炎性因子水平比较

3 讨论

空气污染与人类多种疾病的发生发展有关，可能有多种机制参与，包括氧化应激、炎性损伤及免疫损伤等，但具体机制尚不清楚。近年，关于细颗粒物对机体的有害影响研究很多。颗粒污染物由多种成分和灰尘构成，表面可附着多种毒性成分，PM2.5可经呼吸系统进入血液，被认为是对健康危害最大的空气污染物之一。既往文献报道，空气中PM2.5浓度增加与肺功能指标短时间异常相关，并且与肺炎及慢性气道疾病的发病率、住院率增高相关[3-4]。

文献报道，大鼠暴露于高浓度PM2.5环境中后，BALF中炎性细胞增多，IL-6、IL-10等炎性因子水平升高，TNF-α水平下降；静脉血中CD3+细胞增加，CD4+/CD8+比值降低[5-7]。有体外试验证实，PM2.5可导致急性髓细胞系细胞TNF-α等炎性因子分泌增加[5]。本研究结果显示，与洁净组比较，过滤组和大气组大鼠肺组织出现轻度炎性改变，可见部分肺泡融合形成肺大泡，且IL-1β、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α水平升高；过滤组和大气组BALF中CD8+升高，CD4+/CD8+比值下降。与上述研究结果类似。

本研究结果显示，过滤组与大气组IL-1β、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α、CD8+、CD4+、CD4+/CD8+水平比较差异无统计学意义。分析其原因可能与本研究采用的污染环境暴露条件有关。在此次实验期间，大鼠饲养88 d，其中重度以上空气污染时间41 d，即相对于洁净组和过滤组，大气组大鼠接触高浓度PM2.5环境时间占总观察时间的46.6%。与部分研究采用高浓度PM2.5环境暴露相比，本研究PM2.5为实时空气中的细颗粒物浓度，低于其他采集PM2.5制成混悬液复制雾霾动物模型的毒性。同时过滤舱的过滤膜对于直径<0.3 μm的物质并不能起到过滤作用。近年来，空气动力学直径<0.1 μm的超细颗粒物(UFPs) 对机体的有害影响也逐渐受到重视。文献报道，与同一地点同时采集的PM10和PM2.5相比，大气环境中UFPs多环芳烃含量高，更容易导致细胞损伤[8]。UFPs不止与呼吸系统疾病相关，而且与心血管疾病密切相关[9-10]。由于UFPs颗粒细小、浓度易变、检测难度大，故UFPs尚未纳入日常监测。

张秀川等[10]对2014年北京地区大颗粒物进行分析，结果显示附着在颗粒物表面的有害化学物质苯并芘等多环芳烃与AQI呈正相关。这些物质通过附着在颗粒物或游离状态进入呼吸系统，继而进入循环系统，对系统造成损伤[11]。研究显示高浓度NO2可导致大鼠终末细支气管上皮损伤和气道纤毛破坏[12]。O3浓度增加等空气污染可导致哮喘、急性呼吸道感染、肺炎、慢性阻塞性肺疾病等急诊就诊次数增加，因哮喘急性发作住院率也明显升高[13]。

综上所述，空气污染暴露可导致大鼠肺组织炎症反应，使炎性因子和淋巴细胞分类不同程度改变，可能与IL-1β、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α升高和T淋巴细胞构成改变有关。同时，导致空气质量差的不同直径颗粒物，以及不同成分的作用机制，需要进一步研究探讨。