CRISPR／Cas9系统基因编辑技术*——解读2020年诺贝尔化学奖

王海帆 王予涵 初 明 李 燕 王月丹**

（1 北京大学基础医学院免疫学系 北京 100191 2 北大附中实验学校 北京 100032）

2020年10月7日，瑞典卡罗林斯卡大学医学院诺贝尔奖评选委员会宣布，2020年诺贝尔化学奖授予CRISPR／Cas9 技术的发明者——来自法国的微生物学家埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和来自美国的分子生物学家詹妮弗·杜德纳（Jennifer A.Doudna），以表彰她们在基因编辑技术研究与应用领域中所作出的重要贡献。

诺贝尔奖是当今世界上授予科学家的最高学术荣誉奖励，只有对人类社会和科学发展具有重大影响力的科研成果及其完成人才能获得如此殊荣。卡彭蒂和杜德纳研究的基因编辑技术是什么？该基因编辑技术对人类又有哪些影响和贡献？ 在此，一起学习了解一下。

1 细菌的免疫与CRISPR／Cas9 系统

细菌是一种常见的微生物，体积很小，在动物和植物等其他生物体内均有大量的寄生性细菌。但是，在细菌体内也会有寄生物，这就是被称为噬菌体的病毒。当人体被细菌感染后，人体的免疫系统就会对体内寄生的细菌进行清除，这就是免疫反应的现象。同样，细菌被噬菌体感染后，也会启动其拥有的细菌免疫系统，清除病毒的感染。

长久以来，人们一直都没有发现细菌清除病毒感染的具体机制。直至1987年，日本科学家石野良纯（Ishino Y）在对细菌的研究中发现，在大肠杆菌碱性磷酸酶的编码区下游，存在着一段包括29 个碱基大小的重复片段和32～33 个碱基组成的非重复序列相互间隔串联排列所组成的重复结构区域［1-2］。由于技术条件所限，这种结构区域的功能在当时并未明确，也未引起研究人员的关注。随着现代分子生物学和测序技术的发展，在对细菌的测序工作中，人们发现这种串联性重复结构区域在细菌中广泛存在。为了规范研究，人们将这种串联性重复结构区域命名为成簇规律间隔性短回文重复序列（clustered regul－arly interspaced short palindromic repeats），英文缩写为CRISPR［3］。后来，人们通过对质粒转染细菌的研究，发现这种串联性重复结构区域的功能为清除进入细菌内的噬菌体和质粒等携带的外源性DNA 分子［4-6］，即细菌发挥适应性免疫应答效应的系统［7］。

细菌的CRISPR 结构一般是由编码短回文重复区和间隔区序列组成的串联性重复结构，并与其上游编码CRISPR 相关蛋白（CRISPR-associated protein，Cas 蛋白）的Cas基因、前导区共同组成CRISPR／Cas 系统［1］（图1）。在这个系统中，Cas基因具有非常丰富的多态性，其编码的Cas 蛋白具有核糖核酸结合的结构域，同时还具有核酸内切酶和解旋酶的活性［8］。前导区实际上就是CRISPR 序列的启动子区域，负责结合转录酶，启动CRISPR 序列的转录。CRISPR 序列中的重复序列一般由21～48个碱基组成回文序列，可形成发卡结构；而间隔区则是细菌捕获的来自质粒或噬菌体的外源性DNA片段，即细菌建立的DNA 序列“黑名单”。

图1 CRISPR／Cas 系统基因结构模式图

此系统是如何帮助细菌消灭入侵的外源性DNA 分子的？ 在此，笔者以CRISPR／Cas9 系统为例进行简要说明。在外源性DNA （例如噬菌体DNA）首次进入细菌时，细菌会将外源性DNA 的一段序列整合到其自身基因组CRISPR 结构中的间隔区中，此过程称为适应。当具有同样DNA 序列的噬菌体再次感染细菌时，CRISPR 基因就会被激活转录生成一系列CRISPR RNA（crRNA），每一条crRNA 均包含一段由之前感染的外源性DNA序列转录而来的间隔序列（“黑名单”序列），此过程称为表达。接着，细菌内的一种被称为反式激活crRNA （tracrRNA）的分子，会分别与crRNA 和Cas9 蛋白结合，形成具有酶活性的RNA／蛋白酶复合物。通过碱基的互补配对作用，这个复合体可和带有与crRNA 序列相同的外源性DNA 分子结合，并通过Cas9 的核酸内切酶活性，分别切割与crRNA 互补配对结合的DNA 链及其互补链，使DNA 分子发生双链断裂，从而降解进入细菌的外源性DNA 分子，干扰噬菌体对细菌的感染，此过程称为干扰。

通过识别、转录和干扰3 个步骤，细菌即可通过免疫记忆的方式，特异性地识别噬菌体的DNA序列，并将其降解，从而起到保护细菌正常生存和繁殖的作用。

目前，已经发现的CRISPR／Cas 系统主要分为两大类，其中2 类CRISPR／Cas 系统都只有一个共同的效应蛋白酶——Cas9。CRISPR／Cas9 系统是发现最早、结构最简单、研究最明确及应用最为广泛的CRISPR／Cas 系统。

2 CRISPR／Cas 基因编辑技术的发明与发展

基因是编码一条多肽链或功能RNA 所需核苷酸序列的总和，是记录支持着生命活动基本构造和性能信息的载体，决定了一个生命的生存、生长和凋亡等全部的生理过程和表型。

自从发现核酸和基因以来，人们就一直在尝试通过基因编辑的方式，对基因进行改造，从而实现根本性改变或调节生命活动的目的。在CRISPR／Cas9 系统并应用于编辑基因之前，人们已经在大量使用锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）及转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）等技术，通过可与特定DNA 序列结合的核酸酶靶向特异性的DNA 序列，进行基因的编辑［9］。但是，由于这个过程需要核酸酶蛋白分子与DNA 的特异性结合，每次编辑时，均需要按照靶点序列的不同，重新设计和构建不同的核酸酶蛋白，工作流程复杂，成本很高，单一实验室往往很难完成，因此，其应用范围受到了很大的制约，往往只能用于实验室的科学研究工作。

通过研究，人们发现CRISPR／Cas9 系统导致的发生双链断裂的DNA 分子，也可通过易于发生错误的非同源末端连接的方式进行修复，但这种修复往往会导致基因敲除、敲入和染色体转位等编辑效应。

2011年，卡彭蒂耶团队发表了第1 篇关于CRISPR／Cas9 系统完整结构的论文［10］。他们通过基因分析等实验研究发现，在细菌清除外源性DNA 过程中，共有4 个组成构件参与，分别是一种被称为Csn1 的蛋白质分子（即Cas9）、crRNA、tracrRNA 和一种RNA 酶（RNA 酶Ⅲ）。但在这篇论文中，对于这4 种成分的具体功能，卡彭蒂耶并未给出答案。论文发表后，引起了美国加州大学伯克利分校杜德纳教授的关注。2012年，杜德纳与卡彭蒂耶联手在《科学》上发表论文［11］，揭示了Cas9 是具有RNA 引导下DNA 内切酶活性的蛋白质分子，并在体外非细胞体系中，证实了该分子具有切割任意DNA 分子序列的能力，具有修改基因的活性［12］。这也是杜德纳和卡彭蒂耶获得诺贝尔化学奖的主要成就。

但是，由于在实验中遇到了一些技术性的困难，杜德纳和卡彭蒂耶团队并未能在细胞内成功地完成基因编辑的工作，这也是最终该成果未能获得诺贝尔医学或生理学奖的重要原因。美国华裔科学家张峰在看到卡彭蒂耶论文之后，也开始积极研究基于CRISPR／Cas9 的基因编辑技术，于2013年最终在活体细胞内成功地实现了基因编辑，并且还在不断发展和改进着以CRISPR／Cas系统为基础的基因编辑技术，使人们对细胞的基因编辑技术不断简化和实用。

3 CRISPR／Cas 基因编辑技术的应用

由于CRISPR／Cas 技术中使用的Cas 蛋白分子具有切割任意DNA 序列的能力，具有非常好的通用性和广泛的适用范围，在使用时不再需要像ZFNs 和TALENs 技术那样重新构建新的蛋白质结构，而只需要合成一段引导RNA（gRNA）即可实现对任意的基因进行编辑。这极大推动了基因编辑在各个领域中的应用，目前，CRISPR／Cas 基因编辑技术主要可用于基因功能研究、生物育种和人类疾病的治疗中。

在基因功能的研究方面，CRISPR／Cas 技术可极大缩短基因编辑工具的构建时间周期，提高构建的效率，已广泛应用于斑马鱼、小鼠、食蟹猴、果蝇、线虫、猪、兔等各种动物的基因敲除、敲入和诱导突变等模型的建立，极大推动了人们对各种基因功能的研究和认知，为揭开生命现象的最后密码提供了一件研究的“神器”。

在生物育种方面，CRISPR／Cas 技术能针对作物本身的基因进行定点精准突变或精准编辑，从而能极大提高育种的效率，在农业生产上具有非常重要的应用价值。目前，该技术已在水稻、小麦和大豆等农作物中应用，改善这些农作物在抗病能力、杂种优势、不育性、株高、支链淀粉含量、抗除草剂性能和香味等方面的性能。此外，在番茄、土豆和莴苣等11 个园艺作物品种中也在使用CRISPR／Cas 的基因编辑技术［13］。有人统计，目前已有包括模式植物、农作物、果树等木本植物和草本植物的多达21 个物种，使用该技术进行了基因编辑并取得了成功。在动物育种方面，有人采用CRISPR／Cas 技术，对绵羊胚胎的成纤维细胞进行基因编辑也取得了成功。

在人类疾病治疗方面，CRISPR／Cas 技术获得了巨大的成功。首先，通过对人类胚胎中突变的HBB基因进行编辑修饰，在治疗β－地中海贫血症的患者中取得了巨大的成果，使这种遗传性血红蛋白缺陷病的治愈成为现实。此外，CRISPR／Cas 技术在治疗镰刀形红细胞贫血、血友病及亨廷顿舞蹈病等遗传性疾病方面，也都取得了很大的进展，成为基因治疗的重要技术工具［14］。利用该技术，人们还可对干细胞和CAR-T 细胞等免疫细胞进行基因编辑，敲除与治疗不良反应相关的基因，从而提升干细胞和免疫细胞的治疗效果，减少副作用，在恶性肿瘤等疾病的治疗中，取得了成功，并且在不断地推广。

4 CRISPR／Cas 技术存在的问题与展望

在很短的时间内，CRISPR／Cas 技术就在基因编辑领域中取得了飞速的发展，但在造福于人类的同时，该技术也存在一些问题，并且给人类社会带来了挑战。

首先，由于CRISPR 靶向目的基因的引导片段很短，只有几十个碱基，而人类的基因非常庞大有数10 亿个碱基对，所以，很容易发生引导片段识别非目的基因序列而出现的脱靶现象，造成非目的基因的受损，产生基因编辑相关的损伤。因此，如何提升CRISPR／Cas 系统识别和编辑基因的精准度，是改善该技术应用的重要技术性问题［15］。

另一方面，为了能让CRISPR／Cas 系统的成分发挥基因编辑功能，必须使用一定的递送方法让其能进入细胞。目前，主要的递送方法包括物理递送（例如，显微注射、电转导技术等）、化学递送（例如，使用脂质体、纳米颗粒投递系统等）和生物递送3 种方式。其中，生物递送是临床基因治疗中最常用的递送方法，占临床基因治疗的70%以上。主要用于生物递送的载体是慢病毒、腺病毒和腺相关病毒（AAV）。其中，AAV 免疫原性和生物学毒性都较低，是最为常用的基因治疗病毒载体，但在基因治疗中，AAV 载体相关的死亡事件屡有发生，成为制约基因治疗和基因编辑技术临床应用的“瓶颈”。因此，发展和改良CRISPR／Cas 的递送系统，提升其安全性和有效性，也是基因编辑和治疗技术亟待解决的关键性技术问题。

由于基因是人类的生命密码，对于人类基因的编辑，不仅面临技术发展和改善的问题，也给人类社会生活带来了巨大的挑战。伦理学问题是CRISPR／Cas 基因编辑技术应用时难以回避的问题，哪些人类基因能被编辑？基因编辑后对人类健康和行为有哪些影响？哪些人的基因可被编辑？经基因编辑的人类胎儿是否允许出生？ 在这些问题得到科学和恰当的解答之前，对于人类的基因编辑问题应慎之又慎。

无论如何，CRISPR／Cas 技术给人们又一次带来能改变自己命运的神奇工具，希望人们能用好这把“魔力之剪”，让生活变得更加健康、更加美好、更加幸福。

5 写在最后

因为是奖励化学研究方面的成就，有关CRISPR／Cas 技术的诺奖并未授予在细菌中发现CRISPR 系统的日本科学家石野良纯和首次利用CRISPR／Cas9 技术进行活体细胞基因编辑的美国华裔科学家张峰。但是，正如石野良纯在祝贺2 位科学家获奖时所说的，“但我并不后悔，古细菌的其他研究同样让我感到快乐，并一直支持着我走到今天”。是的，科学的意义在于发现，科学家的研究就是他们的快乐。这就是科学家追求的全部。