MiR-122对结直肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性的影响

张方亮 郭运生 武玉 宣斌 张浩

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是胃肠道中较为常见的恶性肿瘤，早期无明显症状，随着肿瘤的增大，患者可表现出排便习惯改变、便血、腹痛等症状，晚期则可表现出贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌[1]。近几十年来，CRC的诊断和治疗有了很大的进步，早期CRC可以通过手术根治，但因其起病隐匿，多数患者发现时已是癌症的中晚期，手术切除不能完全根治癌症，化疗药起到了极为重要的作用，通过辅助化疗药物治疗可以延长患者的生存期，而且在某种程度上可以改善患者的生活质量。虽然NCCN(National Comprehensive Cancer Network)指南推荐,对于转移性结直肠癌，可使用奥沙利铂(oxaliplatin，L-OHP)联合其他药物[2]，但是由于肿瘤细胞基因容易产生变异，会对化疗药物产生耐药性，导致结直肠癌对化疗药物的敏感性下降。肿瘤细胞的耐药性是影响结直肠癌化疗疗效并导致化疗失效的关键所在。因此研究和认识CRC细胞的耐药性机制对于逆转耐药和减少耐药性地产生，提高化疗效果至关重要。MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的单链非编码RNA，其长度约为22个核苷酸，其在调控肿瘤的发生、发展及耐药中发挥了重要的作用[3]。其中，miR-122在甲状腺癌、食管癌、非小细胞肺癌中，能抑制原发肿瘤生长，然而在T淋巴细胞瘤、垂体瘤和白血病等肿瘤可作为潜在的促癌因子，其高表达可以促进肿瘤进展，并诱导肿瘤的耐药性[4,5]。本研究拟探研究miR-122在结直肠癌细胞对奥沙利铂耐药中的影响，可为提高CRC对奥沙利铂化疗的敏感性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 结直肠癌细胞株(SW620)均购自美国ATCC(American type culture collection)。收集秦皇岛第一医院确诊的结直肠癌患者对奥沙利铂化疗敏感的癌组织(敏感组)、对奥沙利铂化疗耐药的癌组织(耐药组)和癌旁的正常粘膜组织(对照组)。所取标本分成2份：(1)常规病理学检查；(2)-80℃冰箱储存。所有标本在患者悉知并同期的情况下，并由秦皇岛第一医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 组织标本RNA提取:取大小适中的结直肠癌组织标本研磨至匀浆，加入1 ml Trizol，裂解15 min后转移至1.5 ml的EP管中，加入200 μl的氯仿后震荡(15 s)、静置(5 min)、离心(4℃、13 000 r/min、15 min)。收集上清，加入等体积的异丙醇混匀后静置(10 min)、离心(4℃、13 000 r/min、10 min)、弃去上清液。加入75%的乙醇混匀、离心(4℃、13 000 r/min、5 min)、弃去上清液。待乙醇挥发完全后，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 qRT-PCR 检测miR-122在耐药和敏感的结直肠癌组织中的相对表达量:提取组织总的RNA,分光光度计测定 RNA浓度及纯度后按照反转录试剂盒说明进行反转录。反应条件为:预变性(95℃、10 min)，变性(95℃、30 s)，复性(55℃、30 s)，延伸(72℃、1 min),总共进行40个循环。反应完成后，采用 2-ΔΔCT方法来计算分析目的基因的相对表达量及差异。见表1。

表1 引物序列

1.2.3 细胞转染及qRT-PCR鉴定转染效率：接种SW620细胞按照每孔2×105个细胞接种到 6 孔板上，放入培养箱(37℃、5% CO2)中培养。当细胞密度达到80%时，进行转染。以无血清无双抗Opti-MEM培养基稀释miR-122后，轻轻吹打后室温下孵育5 min。加入转染试剂轻轻吹打混匀，室温下孵育10 min。在6孔板的每个小孔中加入转染复合物，轻轻振荡混匀，在 37℃ 5%CO2的培养箱中培养,5～6 h后更换新的培养基。转染后48 h后提取细胞总的RNA，分光光度计测定RNA浓度及纯度后根据反转录试剂盒说明进行反转录，条件为:反转录(37℃、1 h，)，灭活反转录酶(85℃、5 min)。反转录后进行扩增， 扩增条件为:预变性(95℃、30 s)， 变性(95℃、5 s)，延伸(60℃、30 s)，共40个循环。

1.2.4 MTT 法检测细胞活性:取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶进行消化、离心(500 r/min,3 min)、弃去上清液、PBS重悬洗涤(共2次)，以无血清L-15培养基重悬细胞，稀释浓度至1×106 cells/ml可进行奥沙利铂(母液5 mg/ml)加药。将实验分对照组(SW620)、奥沙利铂组(SW620+奥沙利铂)、奥沙利铂/miR-NC组(SW620+miR-NC+奥沙利铂)、奥沙利铂/miR-122组(SW620+ miR-122+奥沙利铂)，加入等量的无血清培养液作为阴性对照组。各组细胞密度达到5×105 cells/ml，加药组奥沙利铂终浓度为50 μg/ml；分别在培养箱(37℃、5% CO2)中培养 1 d、2 d、3 d 3个时间梯度。细胞培养完成后，每孔加入10 μl 的 MTT液(5 mg/ml)，在 37℃下孵育4 h后终止培养，并移除孔中的 MTT 液。每孔加入150 μl二甲基亚砜，放置摇床振荡10 min。酶联免疫检测仪(570 nm波长)检测，测定并记录每孔的 OD 值。

1.2.5 Tran-swell检测细胞侵袭:按照每孔在Transwell 上室加入200 μl上述加药后的细胞悬液，下室加入500 μl培养基(含有10% FBS )，放入细胞培养箱(37℃、5%CO2、48 h)中培养。吸走小室内培养基后PBS洗涤；在下室内加入多聚甲醛(4%、600 μl)固定细胞30 min后吸弃固定液，在下室中加入结晶紫(0.1%、600 μl)染色20 min后弃染色液；再用PBS洗涤后，用棉签擦掉小室内侧的细胞，自然晾干，显微镜下观察拍照。

1.2.6 流式细胞术检测细胞周期:将上述加药后的各组细胞在培养箱(37℃、5% CO2)中培养24 h；使用0.25%的胰酶消化细胞后，将细胞移至1.5 ml EP管内离心(4℃、1 000 r/min、5 min)；弃上清，加入1 ml PBS洗1次后离心(4℃、1 000 r/min、5 min)，弃上清，加入1 ml 70%乙醇，轻轻混匀，在4℃下固定过夜；弃乙醇，PBS洗3次后离心(4℃、1 000 r/min、5 min)，加入PI 染液(600 μl/孔)，轻轻混匀后检测。

2 结果

2.1 qRT-PCR检测耐药和敏感结直肠癌蜡块组织miR-122相对表达量 qRT-PCR检测耐药和敏感结直肠癌组织miR-122相对表达量我们使用了18例组织，2例结直肠癌旁正常的组织，8例对奥沙利铂耐药的结直肠癌组织，8例对奥沙利铂敏感的结直肠癌组织。qRT-PCR检测结果显示:对奥沙利铂耐药的结直肠癌组织的miR-122的相对表达量比结直肠癌旁正常组织高(P<0.01)，对奥沙利铂敏感的结直肠癌组织的miR-122的相对表达量比结直肠癌旁正常组织低(P<0.01)，表明miR-122可能降低结直肠癌对奥沙利铂的敏感性。见表1。

2.2 qRT-PCR检测miR-122转染效率 qRT-PCR检测结果显示：SW620细胞转染miR-122mimics后，miR-122的表达量升高(P<0.01)，说明转染成功。见表2。

表1 qRT-PCR检测耐药和敏感的结直肠癌组织miR-122相对表达量

表2 qRT-PCR检测miR-122转染效率

2.3 MTT法检测miR-122对细胞活性的影响 MTT法结果显示，相比于奥沙利铂/miR-NC组，上调miR-122后，SW620细胞的活性增高(P<0.01),而且其活力随时间呈递增趋势，表明miR-122能够增加SW620细胞的活性。见表3。

表3 MTT法检测miR-122对细胞活性的影响

2.4 Transwell法检测miR-122对细胞侵袭力的影响 Transwell实验结果显示，相比于奥沙利铂/miR-122组，上调miR-122后，增加了SW620细胞的侵袭能力(P<0.01)，表明miR-122能够增加SW620细胞的侵袭能力。见表4，图1。

表4 Transwell法检测miR-122对细胞侵袭力的影响

对照组奥沙利铂组奥沙利铂/miR-NC奥沙利铂/miR-122

2.5 流式细胞术检测miR-122对耐药株细胞周期的影响 流式细胞术结果显示，与对照组相比，奥沙利铂组S期所占比例增加(P<0.05)，说明奥沙利铂将细胞阻滞在S期，与奥沙利铂/miR-NC组相比，上调miR-122后，改变了结直肠癌细胞的细胞周期，S期所占比例减少，G2/M期所占比例增加(P<0.05)，表明miR-122改变了奥沙利铂的S期阻滞，推进了肿瘤细胞的周期进程。见表5。

3 讨论

据2018年全球癌症数据统计，结直肠癌的发病率和死亡率分别位占10.2%和9.2%[6]。结直肠癌的早期无明显症状，这导致患者的疾病早期诊断率较低，当患者表现出贫血、体重减轻等全身症状时，疾病已达到中晚期，这导致患者的5年生存率大大降低，仅有约10%，因此化疗药物成为治疗晚期结直肠癌患者的主要手段。1999年，奥沙利铂的原研药在中国上市，开

表5 流式细胞术检测miR-122对耐药株细胞周期的影响

启了第三代铂类药物在中国的应用，并迅速成为结直肠癌治疗的基石药物。奥沙利铂的上市给肠癌患者的长期生存带来了极大的改善，结直肠癌患者五年生存率提升了约10%，其主要是通过铂-DNA复合物，破坏DNA的正常结构，从而抑制DNA复制和转录，进而诱导肿瘤细胞凋亡[7]。然而，其耐药现象却越发明显，导致部分晚期结直肠癌的患者化疗有效率低，预后差。结直肠癌对奥沙利铂耐药产生的机制十分复杂，包括通过增加奥沙利铂外排、上调耐药基因或蛋白表达、增强肿瘤细胞的自噬能力、加强DNA修复等[8]。全面深入研宄和阐明结直肠癌对奥沙利铂耐药的机制，将对改善结直肠癌患者的预后有极大的获益。

MiRNA是18-24个核苷酸组成的内源性单链非编码RNA，miRNA通过与靶mRNA的3’非编码(3’UTR)结合，可以在转录后水平抑制靶基因的表达，导致mRNA翻译抑制或降解，发挥不可代替的生物学作用。研究表明，其与肿瘤的发生、发展、侵袭、凋亡、转移及耐药都密切相关[3]。研究表表明，过表达的miR-122通过负性调控PKm2，促进肾癌细胞活力、增殖、迁移和糖酵解[9]。MiR-122通过靶向LYN抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[10]。早期的CRC治疗首选为手术根治性切除，但当结直肠癌出现转移时，手术是不可切除的[11,12]。此时，以奥沙利铂为基础的化疗药物是晚期结直肠癌的一线治疗。然而，由于肿瘤细胞基因容易突变，长期使用奥沙利铂通常会降低癌细胞对奥沙利铂的药物敏感性，药物耐药性是临床治疗结直肠癌的一个主要障碍[13,14]。因此探究结直肠癌化疗中奥沙利铂耐药性性的机制尤为重要。在我们的研究中，我们通过qRT-PCR从耐药和敏感的结直肠癌组织中验证miR-122的表达增加，然后我们使SW620细胞高表达miR-122，验证高表达miR-122后，对细胞的活性、侵袭、细胞周期的影响。实验证明，高表达miR-122后，与对照组相比，SW620细胞的活性增加，且随时间呈递增趋势；细胞的侵袭能力增加；细胞周期发生S期阻滞，同时细胞的凋亡比例降低。

综上所述，本实验发现miR-122在对奥沙利铂耐药的癌组织中表达升高，同时增加了癌细胞的活性及侵袭力，推进了细胞周期，从而降低了结直肠癌对奥沙利铂化疗药物的敏感性，这为探究 miRNA 影响结直肠癌对奥沙利铂耐药提供了一个新的理论依据,为逆转结直肠癌奥沙利铂耐药提供新的可能靶点。然而，不足的是我们需要进一步研究miR-122在降低结直肠癌对奥沙利铂化疗敏感性中的机制。