ctDNA在胰腺癌中的表达及意义

李紫宣 冯志林 崔大鹏

据统计，PC的常见病因至今尚不十分清楚，约有90%起源于腺管上皮，由于它具有高发病率，高死亡率和低生存率等特征，在全球范围备受关注[1]。根据美国癌症发病情况年度报告《2020年癌症统计》公布的癌症5年相对生存率来看，PC的生存率仅占9%[2]。同时该研究还指出，仅在2020年内，每天便约有1 600人死于癌症。而从国内公布的最新调查数据来看，PC的五年相对生存率仅占7.2%，发病率、死亡率均居恶性肿瘤的第10位[3]。ctDNA是一种无细胞状态的胞外DNA，是肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或凋亡后释放而进入循环系统的，在血液，滑膜液、脑脊液等中均可寻见其身影。虽然ctDNA的发现，比DNA双螺旋结构还早6年，但对它的研究与肿瘤关联起来的，缺相对较晚。当前所参阅的相关资料中几乎所有种类的癌症均可检测到ctDNA及其所携带的标志性突变。据此而拓展开来的研究数据证也证实，ctDNA特有突变频率越高，且这种现象与肿瘤越晚期，病情越重，肿瘤恶性程度越高呈正相关[4]。如一项针对15中癌症所开展的ctDNA测序实验证实，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期癌症(47%、55%、69%、82%)患者的ctDNA突变频率较其他分期的癌症患者更高，故对其定性、定量和追踪对癌症的治疗举足轻重[5]。尽管如此，当前与PC相关联的ctDNA研究与案例却鲜有涉猎。借此，本文将通过对照试验的方式对PC患者机体中的ctDNA表达水平进行针对性实验，探析其表达及临床意义。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2017年1月至2020年1月就诊于肿瘤科胰腺癌患者47例。全部由病理切片明确诊断，纳入与排除标准均符合《胰腺癌诊治指南(2014年版)》和《胰腺癌综合诊治指南(2018年版)》[6,7]相关要求，且通过本院伦理委员会审核后执行，签署《知情同意书》并提取肿瘤组织做实验标本。其中男31例，女16例；年龄52～80岁，平均年龄(64.75±5.20)岁。按美国癌症联合会(Alternate Joint Communications Center，AJCC)制定的TNM及病理分期系统(第7版)评估：T1/2期11例，T3/4期36例；淋巴结转移：N0/1者：13例，N2/3者34例；病理分型：有淋巴结转移7例，无淋巴结转移40例。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器与试剂：本课题实验部分所需的主要仪器与主要试剂的名称、型号、生产厂家等常规资料如表1所述，仪器操作步骤及注意事项，试剂的操作规范、步骤及注意事项等均按具体使用说明书或根据检测师实际需求而定。见表1。

表1 仪器与试剂

1.2.2 癌组织与癌旁组织的DNA提取：所有PC患者的癌组织和癌旁组织取样与手术切除后1 h内完成，每块组织在1 cm3左右。用PBS冲洗液(1%)冲洗后后装于冻存管，并置于冰盒暂存，然后将其转移至EP试管(1.5 ml)后加入氯仿(200 μl)反复颠倒(40次左右)直至混匀再离心(离心速率：12 000 G/min，离心时间：15 min，离心环境温度：4℃)，转移上清至EP试管(1.5 ml)后加550 μl异丙醇混匀并静置5 min，离心(离心速率：12 000 G/min，离心时间：15 min，离心环境温度：4℃)处理，并去上清。最后置于-80℃冰箱中冻存备用。接着按DNA提取试剂盒操作说明书提取ctDNA大致分5步：①取样剪碎后将其放入离心管(含20 μl蛋白酶K，离心管大小：2 ml)并置于水浴锅(温度：56℃)中使其充分溶解。②加入适量缓冲液(200 μl)后再次将其置入水浴锅(温度：70℃)煎煮10 min。③将无水乙醇(200 μl)加入并混合成液，接着将其移至QIAamp Mini柱中，离心(离心速率：12 000 G/min，离心时间：15 min，离心环境温度：4℃)并去上清。④加入适量AW1缓冲液(500 μl)再离心和去废液，接着加入AW2缓冲液(500 μl)，再离心和去废液。⑤取出实验样本后将其置入新的洗脱管内，加入AE缓冲液(200 μl)后在温室条件下静置60 s，再离心，最后收集溶液和提取DNA。见表2。

1.2.3 QR-PCR检测：取3个EP管(0.2 ml)并分别标记成β-肌动蛋白(β-actin)、SPRY-2、AEG-1，β-actin为内参。接着将RNA逆转录成cDNA，步骤共2步。第一步反应体系的反转录仪的运行条件为70℃，反转录时间5 min，保存条件4℃。第一步结束后接着进行第二步逆转录反应，即将40 μl体系中前5种反应物震荡混匀和离心(离心1 000 g，1 min)处理放置于冰上设置反转录仪条件(37℃条件下60 min，95℃条件下5 min)，4℃条件下恒定时将EP管置于反转录仪上进行反转录反应。Spry2、AEG-1的QR-PCR反应：均在96孔板中进行PCR扩增。反应结束后在此计算各反应管的Ct值(重复实验条件与上述相同，不赘述)，基因突变的QR-PCR检测内容如表4，检测方法按QR-PCR试剂盒说明书执行。所有病理图像分析由≥2名经验丰富的病理科医师评估，分析PC患者机体中的ctDNA在癌组织和癌旁组织中的表达。见表3。

表2 弃去上清步骤

表3 基因突变检测项目

1.3 统计学分析 应用SPSS21.0统计软件，组间配对时的T、P检验采用PRISM 6.0软件处理，双变量相关采用Spearman检验，两个相关样本、独立样本分别采用Wilcoxon检验、Mann-Whitney U检验，PC患者癌组织中的相对表达量为非正常分布，癌旁组织中参数表达则用非参数分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Kras基因G12D位点突变与PC(外周血)病理参数比较 从ctDNA检出角度看，TNM分期(N分期)、性别、年龄等PC病理参数与Kras基因G12D位点突变无相关性(P>0.05)，CA19-9表达、淋巴结转移与Kras基因G12D位点突变相关(P<0.05)。从Kras突变角度看，性别、年龄、CA19-9表达等PC病理参数与G12D、G12V/R突变无显著的相关性(P>0.05)，TNM分期、T分期、N分期与G12D、G12V/R突变相关(P<0.05)。见表4。

表4 PC外周血ctDNA检测Kras基因G12D位点突变与病理参数的关系 例(%)

2.2 QR-PCR检测条件下的PC患者ctDNA判定 通过QR-PCR仪检测结果所绘制的ctDNA的Kras基因的G12D、G12V和G12R位点上的突变型和野生型典型结果来看，检测结果是符合该检测技术的高敏感度(0.001%)和Taqman探针的强特异性的。其中图1-a中的荧光探针信号强度能有效的将突变型、野生型信号区别出来；而图1-b证实此次的ctDNA扩增可分成四个象限，即无扩增、野生+突变、突变型和野生型，并获得其各自的拷贝数。纳入47例PC患者血浆中含有KrasG12D位点突变亚型者共9例(19.15%)，G12V位点突变亚型共3例(6.38%)，无任何G12R位点突变被检测出来，其余的统称野生型突变。见图1。

2.3 PC患者总体生存时间与ctDNA及Kras(G12D)位点突变的关系 通过对PC患者为期2年的随访数据分析发现，47例PC患者中有21例处于Kras突变状态，包括Ⅰ～Ⅱ期的有7例存在ctDNA表达，Ⅲ～Ⅳ期的14例存在ctDNA表达，野生型Kras基因组的总生存时间显著高于突变组(P<0.05)。见表5。

图1 QR-PCR检测的ctDNA突变型和野生型的典型结果图

表5 PC患者总体生存时间与ctDNA及Kras(G12D)位点突变的关系

2.4 PC患者ctDNA表达与CTC增殖关系 Cell Counting Kit-8细胞计数试剂(CCK-8)法检测发现，循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)增殖能力上调与ctDNA表达上调呈正比(P<0.05)。见图2。

图2 ctDNA表达与PC细胞增殖的关系

2.5 影响PC患者总生存时间的危险因素分析 将文中P<0.05的各指标纳入多因素Cox风险比例回归分析，年龄≥65岁、CA19-9≥182 U/ml均不是影响PC患者总生存时间的危险因素(P>0.05)，而ctDNA呈阳性、TNM Ⅲ～Ⅳ期、CTC增殖均是影响PC患者总生存时间的独立危险因素(P<0.05)。见表6。

表6 PC患者的总生存时间的Cox比例风险回归分析

2.6 PC患者的总生存时间的影响因素判断价值 通过Kaplan-Meier分析发现，PC患者总生存时间与CTC增殖、ctDNA、TNM Ⅲ～Ⅳ期的关系密切(Log-rank检验，P分别=0.027、0.015、0.006，P<0.05)。见图3。

图3 PC患者的总生存时间的影响因素判断价值

3 讨论

已有相关研究证实，血浆或血清中游离的ctDNA与PC的发生、发展及转归密切相关已被初步论证[8]。早期诊断困难，是导致PC患者术后总体生存时间偏低的关键因素之一，而结合当前实际情况来看，在PC早期诊断中，有机会实施手术切除者仅占15%～20%，而手术方法作为唯一的、可治愈PC的方法，其临床疗效的好坏，又由诸多因素构成。因此，为提高PC总体预后，提高该病的临床诊断水平和对其肿瘤病变、增殖、转移机制进行针对性研究无疑十分必要。从既往研究来看，大量研究数据已证实CTC在PC早期诊断和预后判断中有不可替代的作用[9]，故拓展以ctDNA为代表的新型PC生物标志物研究途径无疑具有举足轻重的现实意义，这也是本课题为之顺利推进的基础。

脱氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid，DNA)是由脱氧核苷酸(碱基、脱氧核糖和磷酸构成)组成的一种大分子聚合物，是生物细胞内含有的四种生物大分子核酸之一，包括单链DNA、闭环DNA和垃圾DNA三种。DNA是引导生物发育与生命机能运作的关键，与基因的关系十分密切，即基因是有效遗传的DNA片段。有人形象的将ctDNA比作肿瘤细胞留在血液中的指纹，故追查癌症的真凶，分析癌症的各项特征，并以此为基础抑制癌症细胞病变、增殖、转移，甚至清除癌症细胞，弄清ctDNA极其关键，因为ctDNA特有突变评率的高低与肿瘤的分期、病情严重程度及肿瘤恶性程度呈正相关。PC是一种相对常见、多发的消化系统肿瘤，占据其50%，且无论是国内，还是国外，PC的发病率、死亡率均呈现递增态势[10]。肿瘤细胞是ctDNA来源的关键，早在1994年，有科学家在cfDNA中检测到了Kras基因突变。而近年来的诸多研究证实，突变、插入、缺失、重排、拷贝数异常和甲基化等都是ctDNA所携带的特有的变异特征[11,12]。值得注意的是，由于ctDNA片段大小不等，较非肿瘤性cfDNA更大，再加上它受肿瘤负荷大小、肿瘤状态、DNA清除剂降解机制等多种因素的影响，因此想要找到它绝非易事。

本文通过QR-PCR仪检测结果绘制了ctDNA的Kras基因的G12D、G12V和G12R位点上的突变型和野生型的荧光信号图，并在此基础上通过微滴式数字PCR反应获得了其单元总数、荧光信号单元数及样品稀释系数。结果发现，本文检测结果符合检测操作的高敏感度(0.001%)和Taqman探针强特异性。其中图1-a主要区别出来的是突变型、野生型信号，图1-b获得的是ctDNA扩增的四个象限，包括无扩增、野生+突变、突变型和野生型四种，并由此而上述四个象限的各自的拷贝数，这与既往研究结果接近[13]。而从文中纳入的47例PC患者的检测结果来看，有9例PC患者的血浆中含有KrasG12D位点突变亚型，占总数的19.15%，有3例PC患者血浆中含有G12V位点突变亚型，占总数的6.38%，无任何G12R位点突变迹象。而文中KrasG12D位点突变的获得，才是后续实验得以铺叙与推进的关键，也是佐证ctDNA表达在PC早期诊治中有现实意义的基础。在上述研究基础上本文对可能影响PC患者癌组织中ctDNA表达的可能存在的危险因素进行了单因素、多因素分析，最终的Cox风险比例回归分析筛选确定ctDNA呈阳性、TNM Ⅲ～Ⅳ期、CTC增殖是影响PC患者总生存时间的独立危险因素(P<0.05)。其中在PC患者的癌组织中的ctDNA表达呈阳性，提示ctDNA基因位点突变检测可作为CA19-9检测的辅助指标，实现对PC病变全过程的判定依据。但文中CA19-9表达水平与KrasG12D突变与否却无显著相关性(P>0.05)，原因可能来自于样本量偏低所致，而比对既往研究来看，这是应引起重视的。同时，管莎莎[14]对转移性PC患者的癌组织和外周血实验也证实，ctDNA表达存在于该病的早期诊断被检测出来，这说明ctDNA表达极有可能存在于PC的早期病变中。此外，文中G12D位点突变同G12V/R 位点突变的OS显著相关(P<0.05)。故将ctDNA表达作为PC的危险因素可行，而Cox风险比例回归分析提供的依据无疑是最好的佐证[15]。CCK-8法证实，CTC增殖能力上调与ctDNA表达上调呈正比(风险比：4.021，1.223<95%可信区间<7.584，P<0.05)，Log-rank检验下的P=0.027。但ctDNA表达与CTC之间的关系还需后续提供更多依据。

综上所述，PC的发生、发展、转归等过程与ctDNA表达水平相关。将PCR用于PC患者外周血ctDNA表达检测有益，ctDNA呈阳性是影响PC预后不良的重要判定依据，可将其视作PC诊断的一种新型标志物。