养殖大海马烂皮病的病原分离鉴定及其致病性分析

温水秀　邱秦天　宋月鹏　黄柯菁　金珊　解家松　赵青松　徐永健

摘要 2019年6月，浙江某养殖场发生大海马（Hippocampus kuda）批量死亡现象，为探明大海马的发病原因，对患病大海马进行了细菌分离，并获得了2株细菌，编号为HM190601和HM190606。经形态学观察、生理生化特性测定及分子鉴定，确定菌株HM190601为创伤弧菌（Vibrio vulnificus），菌株HM190606为副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）。毒力基因检测显示，菌株HM190601具有vvhA、vvpE、pilA、Wza、vvpE、rtxA、ctxA、toxR、tcpA等毒力因子，菌株HM190606具有pilA、Wza、vvpE、rtxA、ctxA、hlyA等毒力因子。溶血性和人工感染试验表明，菌株HM190601和HM190606均呈β溶血，LD50分别为1.41×105 CFU/g和9.82×102 CFU/g，对大海马具有强致病性。带菌糠虾投喂试验显示，2菌株都可通过大海马肠道感染进入体内，并引起大海马肝肾等组织病变和皮肤溃烂，但要出现典型症状病程，至少需要7 d以上的时间。

关键词 大海马;烂皮病;病原菌鉴定;致病性

中图分类号：S94 文献标识码：B 文章编号：2095–3305（2021）06–0136–06

海马（Hippocampus spp.）又称水马、马头鱼，隶属硬骨鱼纲、海龙目、海龙科、海马属（Hippocampus）。海马具有很高的药用和观赏价值，市场价格较高，但由于过度捕捞和海洋环境的恶化，其野生资源量急剧减少。目前，全世界所有海马种类都已被列为保护物种，野生资源禁止捕捞和进行国际贸易[1]。因此，海马的人工养殖能够在保护海马资源和满足消费者的需求中发挥重要作用。大海马（Hippocampus kuda）是我国土著种，主要分布于东海和南海，体型硕大，具有较高的经济价值，市场需求大，是我国人工养殖研究开展较早的品种之一，也是目前国内养殖的主要品种，但由于受病害的影响，养殖规模和产量至今仍未取得实质性的突破。据报道，大海马的病害主要有寄生虫病、细菌病和真菌病等，特别是由细菌引起的体表溃烂病和肠炎病，发病率高、传染性强，是目前大海马养殖中最为严重的两种疾病[2-6]。

2019年6月，浙江台州某大海马养殖场发生了大海马批量死亡现象，主要病症为海马躯干皮肤溃烂、肝肾组织病变。为了明确大海马的发病原因，对患病大海马进行了细菌分离鉴定及其致病性研究，以期为规模化大海马养殖过程中的疾病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康和患病的大海马均来自浙江台州某海马养殖场，患病大海马平均体质量为4.4±0.2 g/尾，健康大海马平均体质量为2.5±0.1 g/尾。斑马鱼（Danio rerio）购自宁波北仑花鸟市场，平均体长为3.5±0.2 cm。

1.2 主要药品和试剂

TCBS和TSA培养基购自青岛海博生物技术有限公司，API 20E细菌鉴定试剂盒购自生物梅里埃有限公司，2K Plus DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司，2×Taq Master Mix购自康维世纪生物科技有限公司，革兰氏染色液试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.3 细菌的分离纯化

取患典型病症濒死的大海马，体表经无菌生理盐水冲洗后用酒精棉消毒，无菌操作取肝、肾、皮肤溃烂等部位组织划线接种于TSA和TCBS平板培养基上，28℃培养48 h，挑选优势菌落在相同培养基上划线纯化，并观察菌落形态。本实验获得2株纯培养菌株，编号分别为HM190601和HM190606，所获菌株纯培养后，用无菌生理盐水加总浓度20%的甘油，并放置于-80℃的冰箱保存备用。

1.4 细菌形态观察和生理生化特性测定

把获得的2菌株分别接种于TSA斜面，28℃培养24 h后进行革兰氏染色和透射电镜观察。电镜样品制作：先用PBS（pH7.4）制成浓度约107 cells/mL的菌悬液，吸取一滴菌液放在封口膜上，铜网悬吸5 min后，醋酸双氧铀染色20 s，晾干后用日立H-7650透射电镜观察并拍照。细菌生理生化特性测定采用API 20E试剂盒并参考房海[7]、赵乃昕[8]等文献进行。

1.5 菌株的分子鉴定

煮沸法提取2菌株DNA，以提取的DNA为模板，分别对2菌株的16S rRNA和HSP60、topA、gyrB、merB 4个看家基因片段序列进行扩增，得到各目的基因的特异性引物（表1）。具體反应程序：94℃预变性2 min，94℃变形30 s，54℃～61℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃终延伸2 min，进行30个循环。PCR反应体系都为25 μL：2×TaqMasterMix12.5 μL，上下游引物1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳中检测后，送上海华大基因科技有限公司测序，并把测序所获得的16S rRNA基因序列上传至NCBI数据库比对Blast序列，下载相似性≥99%的菌株16S rRNA基因序列，采用Prime5.0整理获得的序列，并利用MEGA6.06软件，采用NJ法构建系统发育树。根据16S rRNA鉴定结果，选取10株模式菌株及1株外群菌株，从Genbank下载HSP60、topA、gyrB、merB看家基因序列，使用上述软件串联4个看家基因，构建系统发育树。

1.6 人工感染试验

用健康海马在实验室水簇箱中暂养2周以上，经检查确认无病进行试验。海马养殖水温为25±1℃，盐度25%，pH 7.6～7.8，试验期间正常投饵，连续充气，日换水量约为60%。

1.6.1 腹腔注射感染试验 分别设HM190601菌组、HM190606菌组、1：1混合菌组及对照组，每组12尾海马。把2菌株分别接种于TSA斜面培养20 h，用0.85%的生理盐水制备成菌悬液浓度约为109 CFU/mL，每尾注射10 ?L，对照组注射等量无菌生理盐水。

1.6.2 口服感染试验 分别设HM190601菌组、HM190606菌组、1：1混合菌组及对照组，每组40尾海马。感染组先用饵料糠虾分别在菌浓度约105 CFU/mL的海水中暂养2 d后进行投喂，每天投喂2次，早上8：00，下午4：00，连续投喂3 d，对照组正常投喂，试验为期28 d。

1.6.3 LD50测定 采用斑马鱼进行，试验设3大组，分别为HM190601组、HM190606组和1：1混合菌组，每大组各设5个不同感染浓度组和1个对照组，每小组15尾鱼。先用0.85%的生理盐水把试验菌制成浓度约为107 CFU/mL的菌悬液，再10倍稀释成5个系列浓度，以此为各小组的感染菌液，每尾鱼注射菌液40 ?L，对照组注射等量无菌生理盐水。试验时水温为28±1℃，试验期间不投饵，连续充气，日换水量约为60%，利用寇氏法计算LD50。

1.7 溶血性试验

把HM190601和HM190606菌株划线接种于TSA平板上培养20 h，取单菌落点种于哥伦比亚血琼脂平板，28℃培养24 h后观测溶血圈的大小。

1.8 毒力基因检测

根据菌株鉴定结果，参考文献筛选出12个毒力基因（vvhA、viuB、pilA、Wza、vvpE、rtxA、ctxA、toxR、tcpA、hlyA、tdh、trh）进行检测（表1）。反应体系和反应程序同1.5，所有引物合成及基因测序都由上海华大基因科技有限公司完成。

2 实验结果

2.1 大海马发病症状

发病大海马为1龄亲体海马，平均体质量（4.4±0.2） g，发病率为60%以上，死亡率约30%。患病初期，大海马进食量明显减少，活力下降，有的不附着在电缆线上，游动没有方向感。随着病情加重，大海马不进食，严重的侧躺在池底，不断蜷缩、挣扎，背腹皮肤出现淡黄色斑点并逐渐扩大转为白色，溃烂脱落，有的露出白骨（图1a）。解剖可见肝变色、有腹水（图1b），有的肾肿大（图1c）。一旦出现明显病症，一般3～5 d就会死亡。

2.2 分离菌株的形态特征及生理生化特性

从患典型病症大海马的肝中分离获得2株疑似病原菌HM190601和HM190606，2株菌均为G-短杆菌，两端钝圆，具极生单鞭毛菌株HM190601大小为（0.6～1.1）×（2.0～2.5）  ?m，菌株HM190606大小为（0.8～1.1）×（1.5～2.3） ?m。2株菌在28℃的TSA平板上培养24 h后均呈白色菌落，直径约2～3 mm;在28℃的TCBS平板上培养24 h后均呈蓝绿色菌落，直径约2 mm。

从2菌株的生理生化特性测定结果可知，2株菌均耐盐，氧化酶、赖氨酸脱羧酶阳性，精氨酸双水解酶阴性，可利用葡萄糖产酸不产气，对O/129敏感，以上这些特征与房海、赵乃昕等资料中所描述的弧菌属细菌主要特征完全一致（表2）。

2.3 菌株的分子鉴定结果

2.3.1 菌株的16S rRNA基因序列分析 通过测序菌株的16S rRNA基因片段，结果显示菌株HM190601序列长度为1 438 bp，菌株HM190606的序列长度为1 400 bp（GenBank登录号分别为MT814720和MT814721）。经BLAST比对结果及利用MEGA6.06构建NJ系统进化树表明，菌株HM190601与Vibrio vulnificus聚类，与V. vulnificus NBRC 15645=ATCC 27562的相似性为99.78%;菌株HM190606与V. parahae-molyticus聚类，与V. parahaemolyticus msr5的相似性为100%（图2）。

2.3.2 菌株的多位点基因序列分析 通过进一步采用HSP60、topA、gyrB、merB等4个看家基因对菌株HM190601和HM190606进行鉴定，结果显示，菌株HM190601的HSP60、topA、gyrB、merB基因片段长度分别为529 bp、720 bp、1115 bp、700 bp，菌株HM190606的HSP60、topA、gyrB、merB基因片段长度分别为521 bp、655 bp、1138 bp、892 bp。通过生物学聚类软件MEGA5.05构建系统发育树，菌株HM190601与创伤弧菌（V. vulnificus）聚成一簇，菌株HM190606与副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）聚成一簇（圖3）。因此，综合2.2和2.3的结果，鉴定菌株HM190601为创伤弧菌，菌株HM190606为副溶血弧菌。

2.4 人工感染试验结果

HM190601菌和HM190606菌对大海马的腹腔注射人工感染结果显示，这2株菌对大海马都具有明显的致病性，单菌感染和混合菌感染48 h，大海马的死亡率均为100%（表3）。其中，HM190601菌感染大海马主要病症为注射部位发炎，肝略肿、有色斑;HM190606菌感染的主要病症为注射部位发炎，肝变软肿胀，腹水较多;而混合菌感染的大海马病症更加多样化，除了单菌感染的一些症状外，有的还出现了肾肿、肠道发炎的症状。带菌糠虾投喂试验显示，2菌株都可以通过大海马肠道感染进入体内且可导致大海马出现体表溃烂症状，而混合菌感染后的症状与自然发病海马病症完全一样，在发病大海马体内又可分离到较纯的感染菌，但大海马出现典型症状时至少是实验7 d以上（表4）。

采用腹腔注射斑马鱼测定2菌株的半数致死量（LD50），得到以下数据（表5）。根据Santos等[16]对细菌毒力的判定标准，菌株HM190601和HM190606都具有强致病性。

2.5 菌株的溶血活性

菌株HM190601和HM190606在28℃的哥伦比亚血平板上培养24 h后均呈β溶血，溶血圈直径分别为13 mm和11 mm。

2.6 菌株的毒力基因检测结果

从2菌株的12种毒力基因检测结果可见，菌株HM190601能检测出9种毒力基因，菌株HM190606能检测出6种毒力基因（表6）。

3 讨论

目前，细菌的分子鉴定一般采用16S rRNA基因，但由于弧菌种间的16S rRNA基因序列相似度极高，对于种水平的鉴定准确性有限。因此，本研究在16S rRNA基因鉴定的基础上，对菌株HM190601和HM190606又进行了HSP60、topA、gyrB、merB 4个看家基因的序列分析，并结合形态学和生理生化特性试验确定菌株HM190601為创伤弧菌，菌株HM190606为副溶血弧菌。

据报道，创伤弧菌和副溶血弧菌都是G-嗜盐条件致病菌，广泛存在于河口、近海及海底沉积物中，是人和动物的常见病原菌。创伤弧菌最早由Hollis[17]等在1976年鉴定为嗜盐性弧菌，1979年被Farmer[18]命名为创伤弧菌，它可引起鳗鲡（Anguilla japonica）、矛尾复虾虎鱼（Synechogobius hasta）、珍珠龙趸（Pearl gentian）、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）、鲻鱼（Mugil cephalus）、黄姑鱼（Nibea albiflora）、赤魟（Dasyatis akajei）、罗非鱼（Oreochromis mossambicus）等多种鱼类及虾、皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）等水产动物疾病。副溶血弧菌最早由Fujino等[19]1953年从日本1例食用咸沙丁鱼中毒患者排泄物中分离并鉴定，1963年被Sakazaki等命名，其后陆续有许多关于该菌感染水产动物的病例被报道，是至今研究相对较多的海水养殖主要病原菌之一，可引起鲻鱼、大黄鱼（Pseudosciaena crocea）、石斑鱼（Epinephelus spp.）、海鲷（Sparus aurata）等多种鱼类和虾、蟹等甲壳类[20-21]及九孔鲍（Haliotis diversicolor）、缢蛏（Sinonovacula constricta）等贝类[22-23]患病死亡。而创伤弧菌和副溶血弧菌引起鱼类的病症很相似，主要为体表出血溃疡、烂鳍烂尾、肝肾等组织病变。目前，关于创伤弧菌和副溶血弧菌引起海马疾病的报道很少，仅Jiang等报道从头颈溃烂的大海马体内分离到一株创伤弧菌，发病大海马死亡前表现嗜睡、内脏发炎和肠道发白等症状;Lin[24]和姜芳燕等曾分别从患肠炎病的灰海马（H.erectus）和大海马体内分离到副溶血弧菌，该菌可以引起消化系统疾病。而本研究的人工感染结果显示，单菌感染和混合菌感染都可引起大海马注射部位发炎溃烂、肝肾等组织病变，其中混合菌感染引起的病症更加复杂多样，主要症状与这二种菌感染鱼类的症状也更为相似。

本研究的结果还显示，菌株HM190601和HM190606都具β溶血活性，对大海马都具有强毒性，其中菌株HM190601含有vvhA、viuB、pilA、Wza、vvpE、rtxA、ctxA、toxR、tcpA等毒力基因，它们可以编码与菌体致病性相关的毒力因子，这些毒力因子与于明明[25]、叶淑瑶[26]等报道的创伤弧菌的主要毒力因子完全相符。而菌株HM190606有pilA、Wza、vvpE、rtxA、ctxA、hlyA等毒力基因，不具有tdh和trh基因，虽然tdh或trh依赖型溶血活性被认为是副溶血弧菌致病性的典型标志，但李妍等[27]的研究结果认为缺tdh和trh基因的菌株其基因组中可能存在其他溶血素基因，从而导致了溶血，这与本研究的结果相同。

此外，已有的一些研究也证实，创伤弧菌和副溶血弧菌都可以通过体表损伤部位或消化道等途径感染水产动物。而对本次大海马发病养殖场的调查显示，大海马日常养殖用水和养殖池等养殖设施均经过严格的消毒，养殖池内面光滑且海马性情温和，不会因互相撕咬而造成体表损伤，由此认为本次病害弧菌直接透过体表造成大海马感染发病的可能性不大。而经过进一步调查发现，在本次大海马发病前一周，曾投喂过从养殖场外塘自然捕获的鲜活糠虾，经检测剩余冻糠虾，发现其弧菌含量很高，与本研究的病原菌存在一定相关性。因此，推测本次大海马发病可能是由投喂含致病菌糠虾饵料引起的，人工感染试验也证实投喂带菌糠虾可导致大海马患病死亡，发病症状与自然发病大海马基本相同。本研究认为当创伤弧菌和副溶血弧菌进入肠道后，由于条件适宜繁殖快速并产生多种毒力因子，这些毒力因子先作用于肠粘膜细胞，使其通透性增强、细胞破坏，进而促使血管通透性增强，大量菌体进入血液并通过血液循环进入肝肾等组织器官引起病变，包括皮肤溃烂，最后机体因全身性感染至各机能衰竭死亡。

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責任编辑：黄艳飞

Abstract In June 2019， a large number of seahorses died in a farm in Zhejiang Province. In order to determine the cause of the disease， tissue samples from diseased seahorses were collected and two pathogenic bacterial strains were isolated and named as HM190601 and HM190606. The HM190601 and HM190606 strains were subsequently identified as Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus by morphological observation， physiological and biochemical characteristics and molecular identification， respectively. The detection test of virulence factors showed that HM190601 strain carried nine virulent genes such as vvhA， vvpE， pilA， Wza， vvpE， rtxA， ctxA， toxR， tcpA， while HM190606 strain expressed only six virulent genes including pilA， Wza， vvpE， rtxA， ctxA， hlyA. Hemolysis test showed that both HM190601 and HM190606 strains were observed to be β-hemolytic. The experimental infections were conducted by intraperitoneal injection with bacterial isolates into zebrafish， and the results showed that both strains were highly pathogenic with the median lethal dose （LD50） value of 1.41×105 CFU/g and 9.82×102 CFU/g， respectively. Feeding test with shrimp Mysis spp. carrying bacteria demonstrated that both strains could cause the pathological changes of liver and kidney， and skin ulceration through the intestinal infection of seahorses， but the typical symptoms did not appear until 7 days.

Key words Hippocampus kuda; Skin ulcer disease; Pathogen identification; Path-ogenicity